配制细胞冻存液
取50ml无菌离心管，于超净台内，加入适量DMEM培养基(含 10%胎牛血清)，再逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度，即 制成双倍的冻存液，置室温下待用。
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HEK293细胞冻存步骤
取准备冻存的细胞，弃去培养基，以DPBS2-3ml洗细胞一次 加入0.5-1.0ml 0.05%的胰酶消化
细 胞 开 始 皱 缩 持但 细不 胞明 正显 常， 形仍 态维
4
细 胞 基 本 皱 缩 胞变 吹圆 打， 可此 下时 。细
5
胞如 脱消 落化 随过 弃头 去， 的会 胰见 酶到 溶许 失液多 。流细
3
大细 不胞 再明 形致显 态密皱 ，，缩 部部变 分分小 细细， 胞胞细 皱维胞 缩持间 变正隙 圆常增
DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)：试验前置室温下。 0.05%的胰酶消化液：37℃预温。 程序冻存盒（加250ml异丙醇）、二甲基亚砜(DMSO)、2ml细胞冻
存管（标记细胞名称、代数、日期）、DPBS（不含钙镁）
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HEK293细胞的冻存
冻存前的准备
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HEK293细胞冻存步骤
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细胞简介
细胞是生命活动的基本单位
1983-39德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立 了“细胞学说”的基本原则
1、细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的 2、每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己的“生命” 3、新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生
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细胞培养技术平台
基因诊疗
药物筛选
细胞培养技术
蔺帅
2013年4月
.
主要内容
1
细胞简介
2
细胞培养技术平台
3 HEK293T细胞的培养具体方法与步骤
4 细胞培养的常见问题与解决方案
5
细胞间的操作注意事项
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细胞简介
细胞是生命活动的基本单位
1665年英国学者Robert Hooke，用自制的显微镜观察软木的 薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文Cella （小室）词.
加入0.05%（37 ℃预温 ）胰酶消化
加入12ml完全培养基（37 ℃预温 ）将细胞从细胞瓶底部冲下
1:4传代即取3ml细胞悬液加入有9ml完全培养基的新细胞瓶中
放入37℃、5%CO2继续培养
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HEK293细胞的传代
加入0.05%胰酶消化
1
2
刚 加 入 胰 酶 细 胞 还 是 致 密 单 层
HEK293细胞在倒置显微镜下的形态
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HEK293T和HEK293细胞
HEK293细胞简介
HEK293细胞株是转染腺病毒E1A基因的人胚肾上皮细胞，由于 容易转染且容易培养，常被用于转染试验。
HEK293T SV40大T抗原
瞬时转染 转染效率更高
HEK293 稳定转染
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HEK293T和HEK293细胞
加入新鲜培养基10-12ml吹打成细胞悬液 收集细胞悬液至50ml无菌离心管，1000rpm，5min离心.弃上清，加入适量培养基
取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，DMSO最后浓度为10%
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HEK293细胞冻存步骤
细胞浓度为1～5×106cells/ml（细胞计数），分装于已标示完全之细胞冻存管中
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HEK293细胞的传代

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HEK293细胞的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ存
随着传代的次数增加，293细胞会出现生长状态下降， 出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存， 以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
原则：慢冻
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HEK293细胞的冻存
冻存前的准备
原代培养 传代培养
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细胞的培养具体方法与步骤
原代培养
用直接从机体获得的细胞进行的培 养称为原代培养。这种培养过程主 要是采用无菌操作的方法，把组织 （或器官）从动物体内取出，经酶 消化处理，使分散成单个细胞，然 后在人工条件下培养，使其不断地 生长和繁殖。原代培养是建立各种 细胞系的第一步。
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HEK293细胞
HEK293细胞生长条件
完全培养基 10%的胎牛血清 DMEM(4.0mM L-谷氨酰胺 4500mg/ml葡萄糖 ) 1%双抗(1000units /L penicillin 1000mg/L streptomycin) 37℃ 5%CO2
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无菌技术
基因诊断
培养细胞 能做什么
治病机理
试管婴儿
组织工程
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细胞的培养具体方法与步骤
细胞培养细胞培养(cell culture) 的含义，简单地说即是把来 自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境 中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁 殖、衰老等生命现象。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、 病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用
将细胞冻存管放入程序冻存盒中（已加250ml异丙醇），置-80℃超低温冰箱
第二天将细胞放入液氮灌，并记录
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HEK293细胞冻存步骤
细胞冻存的注意事项
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细胞的培养具体方法与步骤
传代培养
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到 另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消 化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传 代法或离心法传代。
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HEK293T和HEK293细胞
HEK293细胞简介
瞬时转染
在瞬时转染中重组DNA导入感染性强的细胞系已获得目的基因暂时但高 水平的表达。转染的DNA不必整合进宿主染色体，当用大量的样品需要 在短时间内分析时，尤其是在转然后的1-4天内收获细胞，所得的溶解 产物用于检测目的基因的表达，可以采用瞬时表达的方式。
稳定转染
这种细胞系中转染的目的基因整合到宿主染色体DNA中并指导适量的目 的蛋白的合成。一般来说转染细胞的效率要比瞬时转染的效率低1-2个 数量级。
制定好实验计划和操作程序（准备好实验过程中的一 切用品）
洗手和着装（75%酒精消毒）
进入超净台中的所有物品均需消毒
操作野消毒
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细胞培养耗材
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HEK293细胞的传代

待细胞的融合率达到90%时进行传代。
弃去旧细胞液
4℃遇冷的DPBS（不含Ca2+ 、Mg2+）4ml冲洗后弃液