大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌3罗进贤　李政海　李文清(中山大学生物化学系及生物工程中心,广州510275)摘要 将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶cDNA 重组进同一大肠杆菌2酵母穿梭质粒构建含双基因的表达分泌载体pMA G 15.用原生质体转化法将pMA G 15引入酿酒酵母(S.cerevisiae GRF18),在酵母P GK 基因的启动子和转录终止信号及本身的信号序列的调控下,实现大麦α2淀粉酶和糖化酶的高效表达,99%以上的酶活力分泌至培养基中.构建的酿酒酵母菌株GRF18(pMA G 15)在含15%可溶性淀粉的培养基中,培养47h 能水解99%的淀粉,并能发酵产生酒精.关键词 大麦α2淀粉酶　黑曲霉糖化酶　酿酒酵母　表达和分泌酿酒酵母是酿酒工业、酒精和单细胞蛋白的生产菌,但由于其不具有淀粉水解酶的活力不能发酵淀粉.发酵前淀粉需先经过蒸煮、液化、糖化等工序变成葡萄糖后才能被利用.从80年代中期开始将各种来源的α2淀粉酶和糖化酶基因分别克隆进酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母菌株[1～5].只是由于构建菌株的酶活力不高,降解淀粉的速率较慢还不能用于生产.我们曾将地衣芽孢杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶G AI 的cDNA 分别或同时转入酿酒酵母获得表达和分泌[6～9],其中含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27),酶的表达和分泌水平都很高,但淀粉水解的速率仍较低.本文报道用酶学性质与黑曲霉糖化酶比较接近的大麦α2淀粉酶取代细菌α2淀粉酶,构建含大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母工程菌,实现α2淀粉酶和糖化酶的高表达和分泌,获得能快速分解淀粉的酵母工程菌.1　材料和方法111　材料11111　菌株与质粒 本研究所用菌株与质粒如表1,其中pBAL 27是含大麦α2淀粉酶基因的大肠杆菌2酵母穿梭质粒,pMA G 69为含黑曲霉糖化酶G AI cDNA 的大肠杆菌2酵母穿梭质粒.11112　培养基 大肠杆菌培养和转化用LB 培养基,酵母的培养和转化使用的YPD , 1996209208收稿,1996211205收修改稿 3广东省自然科学基金资助项目中国科学 (C 辑) 第28卷　第1期SCIENCE IN CHINA (Series C )　1998年2月YP GE ,YPSB ,YNB ,SC ,SORB ,YPS 等培养基,其配方见文献[10].表1　菌株与质粒菌株/质粒基因型来源E.coli C600F -,thi 21.leuB6,lac Y1,tonA21,Sup E44Jacob 2Monod 研究所S.cerevisiae GRF18leu2,his3,sta -,ihn-Dr.Hollenburg pBAL 27Amp r ,amy +,L EU ,2μori ,pBR322ori 广东省微生物研究所pMA G69Amp r ,GAI ,L EU 2μori ,pBR322ori 本室构建[8]pMA G15Amp r ,amy +,GAI ,L EU 2μori ,pBR322ori 本研究工作11113　主要生化试剂 限制酶EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ,T 4DNA 连续酶购自GIBCO 2BRL 公司,低熔点琼脂糖、BSA 、A TP 等为Sigma 公司产品.葡萄糖试剂盒为广州环通生物技术公司产品.112　方法11211　质粒的检测和制备 大肠杆菌质粒的检测和制备按Sambrook 的方法[11],酵母质粒的检测按Sherman 的方法[12].11212　质粒的酶解、酶解片段的回收、D NA 分子的连接和大肠杆菌转化 参照文献[11]的方法.11213　酵母原生质体转化 按Burgers 的方法[10].11214　淀粉酶阳性菌落的检测和总酶活力测定 见文献[6].一个酶活力单位定义:p H610,60℃的条件下保温1h 产生1mg 葡萄糖的酶量.11215　培养液中剩余淀粉含量的测定及重组质粒稳定性检测 参照K im 的方法[13].11216　发酵液中酒精含量的测定 采用简易的酒精定量测定法.先配浓度体积分数为1%,3%,5%,7%及9%的酒精标准液.加3mL K 2Cr 2O 4溶液(4%K 2Cr 2O 4溶于20mol/L H 2SO 4)于6mL 刻度试管内,将刻度试管置于加有012mL 饱和K 2CO 3的50mL 比色试管中,加015mL 酒精标准液于比色管中,立即盖好盖子,摇匀,于50℃保温5h.取出后在刻度管内加入3mL 蒸馏水,摇匀,测A 560并以双蒸水代替酒精作对照.以酒精标准液浓度为横坐标,A 560为纵坐标绘制标准曲线.测定发酵液中酒精含量时,用015mL 发酵液取代酒精标准液,测定A 560值后,查标准曲线乘以稀释倍数即得发酵液中酒精含量.11217　SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳 参照文献[11]的方法.2　实验结果211　含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酵母表达载体的构建为使大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母中同时表达,需将这2个基因重组在同一表达载体.大麦α2淀粉酶cDNA 位于质粒pBAL7上酵母P GK 启动子和转录终止信号之间.黑曲霉糖化酶cDNA 位于质粒pMA G 69上.我们设想将pBAL7上含P GK 启动子2大麦α2淀粉酶cDNA 2P GK 转录终止信号的314kb 片段切出转移至质粒pMA G 69上构建含双基因的表达载体.如图1所示,用Hind Ⅲ酶切质粒pBAL7,低熔点琼脂糖凝胶电泳分离314kb 的含α2淀粉酶cDNA 及P GK 调控序列的片段;同时用Hind Ⅲ部分酶切质粒pMA G 69,电泳分离第1期罗进贤等:大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌51　图1　重组质粒pMA G 15的构建P ,T 分别为PGK 基因的启动子及转录终止信号,BA 为大麦α2淀粉酶基因,GA 为黑曲霉糖化酶基因1116kb 的线状质粒DNA.将314及1116kb 的片段以适当比例混合,经T 4DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌C600,筛选Amp r 转化子,经质粒检测和酶切分析,获得α2淀粉酶cDNA 正确插入pMA G 69上合适位点的重组质粒pMA G 15.由于pMA G 69上有3个Hind Ⅲ切点,构建重组质粒时采用Hind Ⅲ部分酶切的方法,可获得酶切位点不同的1116kb pMA G 69线状DNA ,314kb 的α2淀粉酶基因可以在不同的Hind Ⅲ位点插入,用EcoR Ⅰ酶切重组质粒pMA G 15可以判断α2淀粉酶的插入位点(图2).本实验的结果表明不管从那个位点插入都不会影响葡萄糖淀粉酶基因的表达.212　大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌用原生质体转化法将211中构建的重组质粒pMA G 15转入酿酒酵母GRF18,在缺亮氨酸的SORB 再生培养基上筛选转化子,获得能在不含亮氨酸的培养基生长的酿酒酵母GRF1852　中 国 科 学 (C 辑)第28卷(pMA G 15),然后把此转化株GRF18(pMA G 15)转移至缺亮氨酸的YNB 淀粉培养基上,并以酿酒酵母GRF18(pMA G 69),GRF18(pBAL7)及受体菌GRF18作对照,在30℃培养4d 后,倒碘液于平板上,可见在GRF18(pMA G 15),GRF18(pMA G 69)及GRF18(pBAL7)菌落周围均出现淀粉水解圈,其中以GRF18(pMA G 15)最大,受体菌GRF18则不生长(图3);这一结果表明,淀粉酶已在酵母中表达并分泌至胞外.图2　重组质粒pMA G 15的酶切分析1为λcl857S7/Hind Ⅲ,2为pMA G69/EcoR Ⅰ,3为pMA G15/EcoR Ⅰ,4为pMA G69/Hind Ⅲ,5为pMA G15/Hind Ⅲ,6为pBAL7/HindⅢ图3　酿酒酵母转化子在淀粉培养基上形成的水解透明圈1为酿酒酵母GRF18(pMA G15),2为酿酒酵母GRF18(pMA G69),3为酿酒酵母GRF18(pBAL7),4为酿酒酵母GRF18为了进一步研究α2淀粉酶和糖化酶在酵母中的表达和分泌情况,按照文献[6]的方法,将上述酵母转化子接种于不含葡萄糖的YP GE 培养基中,30℃振摇60h ,离心测上清液中的总酶活,用蜗牛酶和超声波将菌体裂解后测胞内酶活力,结果如表2.表2　酿酒酵母GRF18转化子的酶活力酿酒酵母转化子胞外酶活/U ・mL -1胞内酶活/U ・mL -1总活力/U ・mL -1分泌量/%GRF180000GRF18(pMA91)0000GRF18(pBAL7)56.500.5257.0299.10GRF18(pMA G69)90.00.4590.4599.50GRF18(pMA G15)152.300.80153.1099.47表2的结果显示含α2淀粉酶和糖化酶双基因的转化子GRF18(pMA G 15)的总酶活力比含α2淀粉酶或糖化酶单基因的转化子GRF18(pBAL7)及GRF18(pMA G 69)要高,而且99%以上的酶活力都分泌至培养基中.为了证明大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶已在酿酒酵母中同时表达,把酵母转化子GRF18(pMA G 15)及GRF18(pBAL7),GRF18(pMA G 69)的培养上清液用80%饱和度的硫酸铵于4℃沉淀过夜,沉淀用20mmol/L 的磷酸缓冲液(p H6.0)溶解后透析除盐,真空干燥浓缩后,用第1期罗进贤等:大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌53　适量20mmol/L 的磷酸缓冲液溶解,走SDS 2PA GE 电泳,结果如图4.从图中可见GRF18(pBAL7)在43ku 处有1条新带而GRF18(pMA G 69)在67ku 稍大的位置上有1条多余的带(黑曲霉糖化酶的分子量为71ku ).含双基因的转化子GRF18(pMA G 15)在43ku 和71ku 的相应位置上都出现新的带.我们曾将培养上清液用硫酸铵沉淀后上DEAE 2纤维素柱层析亦发现有α2淀粉酶和糖化酶活力,前者在流出液中,后者在500mmol/L 的洗脱液中(数据未列出).以上结果显示α2淀粉酶和糖化酶已在酿酒酵母中同时获得表达和分泌.213　酿酒酵母转化子GRF18(pMAG 15)对淀粉的水解和利用为了检查酿酒酵母GRF18(pMA G 15)的水解和利用淀粉的能力,挑取其单菌落接种于含组氨酸的SC 培养基中,培养60h 后收集菌体,转接至含15%可溶性淀粉的YPS 培养基中,30℃振荡培养,定时取样,测A 510,酶活力及淀粉残余量.图5的结果显示,构建的酵母工程菌GRF18(pMA G 15)在47h 内可水解99%的淀粉,而且水解进程与酵母的生长和酶的生成是平行的.我们曾试过10%的马铃薯淀粉,发现培养50h 亦可将其中99%的淀粉水解掉.这一结果表明GRF18(pMA G 15)的淀粉水解能力比我们构建的含地衣杆菌α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27)要高得多.GRF18(YEpMA G 27)在含10%的马铃薯淀粉的YPS 培养基中需培养7d 才能水解97%的淀粉.图4　表达产物电泳分析1为标准分子量,2为GRF18(pBAL7),3为GRF18(pMA G69),4为GRF18(pMA G15)图5　酿酒酵母GRF18(pMA G 15)在YPS (含15%的可溶性淀粉)中生长、产酶及水解淀粉曲线图1为A 570,2为酶活,3为残余率214　酿酒酵母GRF18(pMAG 15)发酵淀粉产生酒精图6　酿酒酵母GRF18(pMA G 15)在YPS (含15%可溶性淀粉)中产生酒精曲线1为淀粉残余率,2为酒精含量为了考察构建的酵母工程菌能否将淀粉水解产物发酵产生酒精,将GRF18(pMA G 15)接种于含10%可溶性淀粉的YPS 培养基中,定时取样,按材料与方法中介绍的方法测定培养上清液中的酒精含量及淀粉残余量.图6是酿酒酵母GRF18(pMA G 15)水解淀粉和发酵产生酒精的进程.虽然酿酒酵母GRF18是实验室菌株不是酒精的生产菌,但从图上可以看到,构建的酵母工程菌在水解淀粉的同时还可发酵产生酒精,为构建能水解和利用淀粉生产酒精的酵母工程菌打下基础.54　中 国 科 学 (C 辑)第28卷215　重组质粒pMAG 15在酵母工程菌中的稳定性带2μ质粒的酵母转化子在无选择压力的情况下,经多代培养都会不同程度地产生质粒丢失的现象.为了检测来源于2μ的重组质粒pMA G 15在酵母转化子GRF18中的稳定性,挑取GRF18(pMA G 15)单菌落接种于YPD 液体培养基中,30℃连续培养5d 后,取样涂平板,分离单菌落,点种于缺亮氨酸的SC 选择培养基及YPD 完全培养基上,30℃培养2d.在YPD 培养基上生长而在SC 培养基上不能生长者即为丢失质粒的转化子.从表3的结果可知,重组质粒pMA G 15的丢失率为913%.表3　重组质粒pMA G 15在酿酒酵母GRF18中的稳定性转化子名称YPD 上总菌落数SC 上不长菌落数丢失率/%GRF 18(pBAL7)51624547.5GRF18(pMA G69)51614 2.7GRF18(pMA G15)516489.33　讨论本文报道将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因引入酿酒酵母在P GK 启动子和转录终止信号的调控之下获得高表达;在本身信号肽的引导下,表达产物的99%分泌至胞外,构建的酿酒酵母工程菌GRF18(pMA G 15)在含15%淀粉的YPD 培养基中培养47h 将99%的淀粉水解.我们曾用地衣杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶基因构建表达载体转化酿酒酵母;获得的酵母工程菌GRF (YEpMA G 27)比仅含α2淀粉酶或葡萄糖淀粉酶单基因的工程菌的酶活力及淀粉水解率都高,但水解淀粉的速度慢[9].估计是由于这两种酶的性质特别是作用的温度(80℃,60℃)和p H (7,4.5)不同造成的.本文用大麦α2淀粉酶取代地衣杆菌α2淀粉酶取得良好的效果,淀粉水解时间从6d (10%淀粉)缩短至47h (15%淀粉).这与大麦α2淀粉酶的最适温度(68℃)和p H (5.2)与黑曲霉糖化酶的最适p H 和温度接近有关.在构建表达载体pMA G 15时,大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因的信号序列均未被除去.这2个酶都是靠本身的信号肽被引导至胞壁再分泌至胞外的.我们的工作已经证实,黑曲霉糖化酶信号肽切除位点的氨基酸残基与酵母信号肽切除位点的相同,因而能被酵母识别和加工[8].但大麦α2淀粉酶信号肽序列与酵母的不完全相同,却能高效表达和分泌,原因有待进一步研究.参 考 文 献1　Rothstain S J ,Lahners K N ,Lazarus C M ,et al.Synthesis and secretion of wheat α2amylase in S acharom vces cerevisiae .G ene ,1987,55:3532　Pretorius I S ,Laing E ,Pretorius G H J ,et al.Expression of a bacillus α2amylase gene in yeast.Current G enetics ,1988,14:13　Cole G E ,McCabe P L ,Inlow D ,et al.Stable expression of aspergillus awamori glucoamylase in distiller ’s yeast.Bio/Tech 2nology ,1988,6:417第1期罗进贤等:大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌55　56　中 国 科 学 (C　辑)第28卷4　Segoard M,Svenson B.Expression of cDNAs encoding barleyα2amylase1and2in yeast and characterization of the secreted proteins.G ene,1990,94:1735　Shibuya I,Tamura G,Shima H,et al.Construction of anα2amylase/glueoamylase fusion gene 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