*基金项目：北京中医药大学自主课题(编号:2011－JYBZZ －XS077)通络救脑注射液对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆及氧化应激反应的影响*Effects of Tongluo Jiunao Injection on learning and memory and oxidative stress response for Alzheimer's Disease Rat Models刘洋Liu Yang 1，李澎涛Li Pengtao 2，刘希伟Liu Xiwei 1，南一楠Nan Yinan 1，都文渊Du Wenyuan 11．北京中医药大学基础医学院中西医结合基础(病理)，北京110029Integration of Traditional Chinese Medicine and Western Medicine Subject (Pathology )in Basic Medical College of BeijingUniversity of Traditional Chinese Medicine ，Beijing ，China 1100292．北京中医药大学东直门医院，北京100700Dongzhimen Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine ，Beijing ，China 100700摘要：目的:探讨通络救脑注射液(Tong Luo Jiu Nao injection ，TLJN )对阿尔茨海默病(Alzheimer ’s Disease ，AD )模型大鼠的防治作用及其抗氧化机制。
方法:采用脑内定位注射β淀粉样蛋白(βamyloid1-42)建立AD 大鼠模型，在模型建立成功的同时给予TLJN 治疗。
采用Morris 水迷宫进行AD 大鼠的行为学检测，用化学比色法检测大脑皮质丙二醛(MDA )的含量。
结果:与正常组比较，AD 模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P ＜0．01)，目标象限停留时间明显缩短(P ＜0．01);TLJN 治疗组大鼠逃避潜伏期明显缩短(P ＜0．05)，目标象限停留时间明显增加(P ＜0．05)。
AD 模型组大鼠脑皮质中MDA 含量增加(P ＜0.01);TLJN 治疗组，脑皮质MDA 含量显著减少(P ＜0．01)。
结论:TLJN 具有改善学习记忆能力，对抗大鼠神经系统的退行性病变有一定的作用，可能通过抑制AD 模型大鼠脑皮质MDA 产生发挥其保护作用。
Abstract :Objective :To explore the preventive and therapeutic effect and anti-oxidation mechanism of Tong Luo Jiu Nao injection(TLJN )in Alzheimer's Disease (AD )rat models．Methods :The AD rat model was established by injecting β-amyloid1-42into the ratbrain ，and successful model rats were given TLJN injection treatment at the same time．The behavioral changes of the AD rats were test-ed with Morris water maze．Chemical colorimetry was used to measure malondialdehyde (MDA )content in the cerebral cortex．Results :Compared with the control group ，the escape latent period of AD rats was significantly longer (P ＜0．01)，retention time of the target quadrant significantly obviously reduced (P ＜0．01);After TLJN treatment ，the escape latent period of AD rats was significantly shorter (P ＜0．05)，and retention time of the target quadrant was significantly increased (P ＜0．05)．In AD model group ，the MDA content in cerebral cortex was increased significantly (P ＜0．01);while after TLJN treatment ，the MDA content in cerebral cortex was decreased obviously (P ＜0．01)．Conclusions :TLJN treatment has certain effects on improving learning and memory ability of AD rats and resisting retrogression of rats nervous system ，and plays protective role in AD rats possibly via inhibiting the production of MDA．关键词：阿尔茨海默病;通络救脑注射液;Morris 水迷宫;学习记忆;氧化应激反应;大鼠Key words :Alzheimer's Disease (AD );Tongluo Jiunao injection ;Morris water maze ;learning-memory ;oxidative stress response ;rat 中图分类号CLC number ：R285．5文献标识码Document code ：A文章编号Article ID ：1674－8999（2012）12－1614－03阿尔茨海默病（Alzheimer ’s Disease ，AD ）是一种继心血管病、癌症、脑卒中后严重威胁人类健康的高发性神经退变性疾病。
但目前临床上对于AD 的病因和发病机制尚不完全清楚，对于其治疗仍旧是一个世界性的难题。
近些年来，对于AD 的发病机制研究方面取得了很多进展，主要集中在遗传因素、环境因素、免疫-炎性机制、氧化应激和细胞凋亡等方面，而氧化应激在AD 中的作用越来越受到研究者的重视。
结合本研究团队多年体内外实验研究，发现AD 的中医病机关键为“毒损脑络”［1-2］。
因此，本实验采用大鼠双侧海马注射A β1-42这一致毒片段以模拟“毒损脑络”病证，观察“毒损脑络”病证下AD 大鼠学习记忆变化情况及氧化应激反应的改变，采用针对该中医病机关键具有解毒通络作用的中药复方通络救脑注射液进行干预，通过Morris 水迷宫行为学检测方法观察药物干预后大鼠学习记忆的改善情况及通络救脑注射液的作用机制，为通络救脑注射液的临床应用提供体外实验依据。
1材料与方法1．1动物分组清洁级雄性SD 大鼠32只，体质量（250ʃ20）g ，购自北京维通利华实验动物中心。
随机分成正常对照组（正常组）、A β海马注射组（模型组）、A β海马注射+通络救脑注·4161·射液组（TLJN组）、Aβ海马注射+多奈哌齐组（阳性药物组），每组8只。
所有动物均在北京中医药大学屏障环境动物实验室（SYXK京2011－0024）饲养，自由饮食，明暗各12 h。
1．2药物与试剂Aβ1-42（sigma公司）；通络救脑注射液（天津红日药业股份有限公司，生产批号：20090630）；水合氯醛（北京化学试剂公司）；硫酸庆大霉素注射液（石药集团欧意制药有限公司）；盐酸多奈哌齐片（法国PFIZER PGM公司）。
1．3AD模型的制备［3-4］将Aβ1-42干粉剂溶于无菌生理盐水（2g·L－1），在37ħ保温箱中孵育1周，使其变为凝聚态Aβ。
大鼠经腹腔注射体积分数10%的水合氯醛（4mL·kg－1）麻醉后，固定于江湾Ⅰ型C大鼠立体定位仪上，常规备皮消毒，切开皮肤，暴露前，参照包新民等的《大鼠脑立体定位图谱》在右侧海马区（前囟后3．0cm，中线右侧2．0cm）用牙科钻钻开颅骨，切开硬脑膜，用微量注射器自脑表面垂直进针2．5cm，缓慢注入凝聚态Aβ1-425μL，留针5min，以使Aβ充分弥散，然后缓慢撤针，缝合切口。
1．4给药方法［5］造模后2d开始给药，根据本实验室前期动物实验结果，选择通络救脑注射液组按4．5mL·（kg·d）－1的剂量灌胃给药；阳性药治疗组将安理申片磨碎，加入蒸馏水制成溶液，0.92mg·（kg·d）－1，按0．700mL·（g·d）－1灌胃；模型组及正常组给予等体积的双蒸水，均每日1次，共3周。
1．5Morris水迷宫行为学测试［4］Morris迷宫为一个不锈钢的圆柱形水池，水池底部及内壁均涂成黑色，直径为120cm，高50cm，水池壁标明4个入水点，由此将水池等分为4个象限（按逆时针方向定义为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），盛水后水深约30cm，水温控制在（22ʃ1）ħ。
将一直径11cm、高29cm的平台固定于其中任一象限，平台在水平面下1cm。
迷宫上方安装有摄像头并与计算机相连接，自动录入大鼠游泳轨迹进行分析。
定位航行实验检测方法：各组动物均于造模后2d给予药物干预，在给药21d后开始Morris水迷宫测试。
所有实验动物适应性游泳90s，连续4d进行大鼠逃避潜伏期实验，具体方法如下：每只大鼠每次测试时间为90s。
测试前先将动物放置在平台上适应10 s，令其进行空间定位。
然后将动物从未放置平台的象限轻放入水中，计时开始，持续90s。
将大鼠入水至找到平台所需时间定义为逃避潜伏期。
若大鼠在规定90s时间内能够找到平台，并在平台停留超过2s者视为寻台成功，其潜伏期则为实际寻台所用时间；若寻台失败，其潜伏期90s。
如果大鼠90s内不能找到平台则由实验者用手牵引其到平台上停留10s，再放回到笼中。
每天每只动物测试4次。
每只动物测试完一个象限后休息3h再进行下1次测试。
每天动物测试顺序、入水象限、测试时段保持一致。
空间探索实验检测方法：实验第5天，撤除平台，将大鼠从平台所对象限放入水中，记录60s内大鼠在原平台所在象限的游泳时间（即：目标象限停留时间）。