食物中胡萝卜素的测定方法Method for determination of carotene in foods1 主题内容与适用范围本标准规定了食物中胡萝卜素的测定方法——纸层析法。

本标准适用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡萝卜素的测定，其最小检出限为0.11μg。

2 原理以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色纱分离；剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。

3 试剂3.1 石油醚（沸程30～60℃）：同时是展开剂。

3.2 丙酮：分析纯。

3.3 丙酮-石油醚混合液：3：7（V/V）。

3.4 无水硫酸钠：分析纯。

3.5 5%硫酸钠溶液。

3.6 1：1氢氧化钾溶液：取50g氢氧化钾溶于50mL水。

3.7 无水乙醇：需经脱醛处理。

3.8 β-胡萝卜素标准溶液：取5mgβ-胡萝卜素标准品，溶于10mL三氯甲烷中，浓度约为500μg/mL，准确测其浓度。

取标准溶液10.0μL，加正己烷3.00mL，混匀，测吸光值，比色杯厚度1cm，以正己烷为空白，入射光波长450nm，平行测定三份，取均值。

计算公式： (1)式中：X1——胡萝卜素标准溶液浓度，mg/mL；A——吸光值；E——β-胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长450nm，比色杯厚度为1cm，溶液浓度为1ppm的吸光系数，为0.2638；——将ppm,换算成mg/mL;——测定过程中稀释倍数的换算。

3.9 β-胡萝卜素标准使用液：将已标定的标准液用石油醚准确稀释后，每毫升溶液相当50μg，避光保存于冰箱中。

4 仪器和设备4.1 实验室常用设备。

4.2 玻璃层析缸。

4.3 分光光度计。

4.4旋转蒸发器：具150mL球形瓶。

4.5 恒温水浴锅。

4.6 皂化回馏装置。

4.7 点样器或微量注射器。

4.8 新华滤纸：定性，快速或中速，101号。

5 样品的采集和处理5.1 粮食：样品用水洗三次，置60℃烤箱中烤干，磨粉，储于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。

5.2 蔬菜与其他植物性食物：取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内，冰箱内保存备用。

6 测定步骤（以下步骤需在避光条件下进行）6.1 样品提取6.1.1 取适量样品，相当于原样1～5g（含胡萝卜素约20～80μg）的匀浆，粮食样品视其胡萝卜素含量而定，置100mL带塞锥形瓶中，加入丙酮20mL，石油醚5mL，振摇1min，静置5min，将提取液转入盛有100mL5%硫酸钠溶液的分液漏斗中，再于锥形瓶中加入10mL丙酮-石油醚混合液，振摇1min，静置5min，将提取液并入分液漏斗中。

如此提取2～3次，直至提取液无色为止。

6.1.2 植物油和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品（＜10g＝，加脱醛乙醇30mL，再加10mL1：1氢氧化钾溶液，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却，皂化后样品用石油醚提取，直至提取液无色为止。

6.2 洗涤6.2.1 将提取液（6.1.1）静置分层，弃去下层水溶液，反复用5%硫酸钠溶液振摇洗涤，每次约15，直至下层水溶液清亮为止。

6.2.2 将皂化后样品提取液（6.1.2）用水洗涤至中性。

6.2.3 将6.2.1或6.2.2的石油醚提取液通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。

6.3 浓缩与定容将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为60℃，蒸发至约1mL时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加入2.00mL石油醚定容，备层析用。

6.4 纸层析6.4.1 点样：在18cm×30cm滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点（如图1所示），吸取0.100～0.400mL浓缩液(6.3)在AB和CD间迅速点样。

图16.4.2 展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。

6.4.3 洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有5mL石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入溶剂中。

6.5 比色测定用1cm比色杯，以石油醚调节零点，于450nm波长下，测吸光度，以其值从标准曲线上查出β-胡萝卜素的含量，供计算时使用。

6.6 标准曲线绘制取–胡萝卜素标准使用液（浓度为50μg/mL）1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00mL分别置于100mL具塞锥形瓶中，按样品测定步骤进行操作，点样体积为0.100mL，标准曲线各点胡萝卜素含量依次为2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00μg。

为测定低含量样品，可在0至2.50μg间加做几点，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线（见图2）。

图2 实测图例胡萝卜素标准曲线图7 计算 (2)——样品中胡萝卜素的含量，以β-胡萝卜素计，mg/100g；式中：X2——在标准曲线上所查得的胡萝卜素的含量，μg；——点样体积，mL；——样品石油醚提取液浓缩后的定容体积，mL；——样品质量，g。

8 结果的允许差同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值、应用范围该方法用于预混料中β－胡萝卜素的定量分析2、原理样品被KOH水溶液皂化，β－胡萝卜素被乙醇和环己烷萃取出来，用乙醇和异丙醇稀释后，用分光光度计测定β－胡萝卜素含量。

3、分析过程3.1 3mol/L的KOH溶液：将34.0gKOH溶于水，然后定容到200.0ml3.2 样本溶液配制精确称取含大约10mgβ－胡萝卜素到锥形瓶中。

加入20ml 3mol/L的KOH溶液，在65℃（超声或水浴中震摇）15min，冷却后加入50.0ml环己烷和50.0ml无水乙醇，用磁搅拌子以700转/分的速度搅拌至少5min，（或强烈震摇10min,使均匀），取该溶液1ml用异丙醇定容到10ml 在最大波长452nm测定吸光度，用异丙醇做空白。

4、计算结果A（吸光度）×稀释量×0.955（校正因子）取样量（mg）×250A（吸光度）×50（环己烷量）×10（异丙醇定容量）×0.955（校正因子）取样量（mg）×2501％β－胡萝卜素取0.10－0.12gGB/T5009.83--2003 食物中胡萝卜素的测定本方法检出限：高效液相色谱法为5.0mg/kg（L），线性范围为0~100mg/L；纸层析法为0.11μg，线性范围1 ng～20ng。

第一法高效液相色谱法2. 原理试样中的β-胡萝卜素，用石油醚丙酮（80 20）混合液提取，经三氧化二铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。

3 试剂3.1石油醚：沸程 30℃~60℃。

3.2甲醇：色谱纯。

3.3丙醇。

3.4己烷。

3.5四氢呋喃。

3.6三氯甲烷。

3.7乙腈：色谱纯。

3.8三氧化二铝：层析用，100-200目，140℃活化2h，取出放入干燥器备用。

3.9含碘异辛烷溶液：精确称取碘1mg，用异辛烷溶解并稀释至25mL，摇匀备用。

3.10α-胡萝卜素标准溶液：精确称取1mgα-胡萝卜素，加入少量三氯甲烷溶解，然后用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入25mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为40μg/mL，放入-18℃储存备用。

3.11β-胡萝卜素标准溶：精确称取β-胡萝卜素12.5mg于烧杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入50mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为250μg/mL。

-18℃储存备用。

二个月内稳定。

根据所需浓度取一定量的β-胡萝卜素标准液用移动相稀释成100μg/mL。

3.12β-胡萝卜素标准使用液：分别吸取β-胡萝卜素标准溶液0.5、1.0、2.0、 3.0、4.0、5.0mL于10mL容量瓶中，各加移动相至刻度，摇匀后，即得β-胡萝卜素标准系列，分别含β-胡萝卜素5、10、20、30、40、50μg/mL。

3.13β-胡萝卜素异构体：精确称取1.5mgβ-胡萝卜素于10mL容量瓶中，充入氮气，快速加入含碘异辛烷溶液10mL，盖上塞子，在距20W的荧光灯30cm处照射5分钟，然后在避光处用真空泵抽去溶剂，用少量三氯甲烷溶解结晶，再用石油醚溶解并定容至刻度，浓度为150μg/mL，-18℃保存。

4仪器4.1高效液相色谱仪4.2离心机4.3旋转蒸发仪5分析步骤5.1试样提取5.1.1淀粉类食品：称取10.0g试样于25mL带塞量筒中（如果试样中β-胡萝卜素量少，取样量可以多些），用石油醚或石油醚丙酮（80 20）混合液振摇提取，吸取上层黄色液体并转入蒸发器中，重复提取直至提取液无色。

合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干（水浴温度为30℃）。

5.1.2液体食品：吸取10.0mL试样于250mL分液漏斗中，加入石油醚丙酮（80 20）20mL提取，然后静置分层，将下层水溶液放入另一分液漏斗中再提取，直至提取液无色为止。

合并提取液，在旋转蒸发器蒸发至干（水浴温度为40℃）。

5.1.3油类食品：称取10.0g试样于25mL带塞量筒中，加入石油醚丙酮（80 20）提取。

反复提取，直至上层提取液无色。

合并提取液，于旋转蒸发器蒸发至干。

5.2纯化将5.1.1，5.1.2，5.1.3的试样提取液残渣，用少量石油醚溶解，然后进行氧化铝层析。

氧化铝柱为1.5cm（内径）×4cm（高）。

先用洗脱液丙酮石油醚（5：95）洗氧化铝柱，然后再加入溶解试样提取液的溶液，用丙酮石油醚（5：95）洗脱β-胡萝卜素，控制流速为20滴/min，收集于10mL容量瓶中，用洗脱液定容至刻度。

用0.45um微孔滤膜过滤，滤液作HPLC分析用。

5.3测定5.3.1HPLC参考条件：色谱柱： Spherisorb C18柱 4.6 mm×150mm。

流动相：甲醇乙腈（90 10）流速：1.2mL/min波长：448nm5.3.2试样测定：吸取“5.2”项已纯化的溶液20ul依法操作，从标准曲线查得或回归求得所含β-胡萝卜素的量。

5.3.3标准曲线：分别进标准使用液20ul，进行HPLC分析，以峰面积对β-胡萝卜素浓度画标准曲线。

6结果计算见式（1）。

V×C 1X=--------×1000×------------ (1)m 1000×1000式中：X－试样中β-胡萝卜素的含量，单位为克每千克或克每升（g/kg或g/l）；V－定容后的体积，单位为毫升（mL）；C－试样中β-胡萝卜素的量（在标准曲线上查得），单位为微克每毫升（μg/mL）；m－试样的量，单位为克或毫升（g或mL）；计算结果保留两位有效数字。