七、体内原位瘤生长和肺转移试验
实验用8~10周龄的雌性BALB/c小鼠。先将 4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2细胞 在指数增长期时消化下来，用PBS充分清洗后用 DME-10培养基重悬并计数(5x107/ml)将小鼠分为 ３组，每组11只。用戊巴比妥钠(50mg/kg体重)麻 醉小鼠，在每只小鼠的第五对乳腺各接种10μ l细 胞。４周后，处死并称取原位瘤重量，观察肺表 面转移结节数，并作统计学分析。实验重复３次 。
Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌 细胞肺转移能力
立项依据
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Akt1是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，可通过
磷脂酰肌醇３激酶(PI3K)依赖的机制被胞外信号激活
。目前发现Akt有三个家族成员Akt1／PKBα 、Akt２／
PKBβ 、Akt３／PKBγ 。它们的氨基端含有１个血小板
－白细胞ｃ激酶底物同源结构区域(PH)可介导脂质—
MTT法检测4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1siAkt1-2细胞的增殖能力
4T1-Control ，4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2 细胞荷瘤小鼠的原位瘤重量
Transwell法检测4T1-Control， 4T1-siAkt11和4T1-siAkt1-2的细胞迁移能力
蛋白质和（或）蛋白质—蛋白质之间的相互作用。Akt
通过ＰＨ区特异性与PI3K的类脂产物磷酯酰肌醇
3,4,5-三磷酸结合募集到细胞膜上，并通过上游磷脂
酰肌醇依赖性激酶1,2(PDK1、PDK2）磷酸化进入活化
状态。激活的Akt重新定位到胞质、核内或细胞内的其
他部位，磷酸化大量的底物蛋白，最终调节细胞的增
实验结果
Akt1干扰载体pLKO.1-Control，pLKO1.1-siAkt1-1 和pLKO.1-siAkt1-2的酶切鉴定电泳图谱
定量PCR检测4T1-control，4T1-siAkt1-1和 4T1-siAkt1-2细胞中Akt1mRNA表达量
免疫印迹检测4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1siAkt1-2细胞中Akt1蛋白表达量
研究目标和内容
作为一种原癌基因,Akt1在许多人类肿瘤中表达显 著增高，促进肿瘤转移；但也有研究表瘤发生发展过程中的作用，采用RNA干扰技术 沉默了高转移小鼠乳腺癌细胞4T1中Akt1的表达。MTT 法检测发现,Akt1沉默不影响4T1细胞的增殖能力。Transwell法检测证明,Akt1沉默可降低4T1细胞的迁移能 力。与以上结果相一致,Akt1沉默不影响乳腺癌形成原 位瘤的能力，但显著降低其体内肺转移能力。结果表 明,Akt1在小鼠乳腺癌细胞转移过程中发挥重要作用， 并提示Akt1可能成为乳腺癌治疗的靶点。
殖、分化、存活和迁移等。
近年来研究发现，Akt1不但影响肿瘤细胞 的增殖、凋亡，而且对许多肿瘤的侵袭和转移 也有影响。Akt1基因在人胃癌中表达增加；活 化的Akt1促进人类胰腺癌细胞、纤维肉瘤细胞 和成纤维细胞的侵袭能力，但可抑制MDA-MB-2 ３１细胞的迁移能力。在乳腺癌中也发现Akt1 异常表达和活性改变，并在乳腺癌的转移过程 中发挥重要的作用。降低Akt1水平抑制Erb-2介 导的乳腺癌体内转移；而过表达myr-Akt1可抑 制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。Akt1活化 还可促进Erb-2介导的乳腺肿瘤发生但抑制其侵 袭能力。这些结果表明，Akt1在不同的细胞型 或肿瘤的不同发展阶段所起的作用也不同。
计划和方案设计
一、细胞株与培养基 小鼠乳腺癌细胞株4T1 细胞培养用培养基为DME-10培养基 培养环境为37℃培养箱，饱和湿度,5%CO2,0.25%的胰
-酶0.02％EDTA消化传代细胞。 二、Akt1干扰载体的构建
慢病毒载体plko.1-puro质粒与已设计好的干扰序列 Akt1-1、Akt1-2和小鼠已知基因无同源性的DNA干扰序列 为阴性对照（表1)合成的寡核苷酸退火形成双链DNA片断 ，克隆到U6启动子下游的EcoRI和AgeI酶切位点(EcoRI和 AgeI酶切位点之间原先存在约1800bp的无关DNA片断）， 转入大肠杆菌DH5α 。EcoRI和AgeI双酶切筛选得到阳性克 隆pLKO.1-siAkt1-１,pLKO.1-siAkt1-1-2和pLKO.1Control,并测序验证。
三、Akt1沉默细胞株的构建:用磷酸钙法转染HEK293T细 胞并经过嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞株4T1-siAkt11、4T1-siAkt1-2和对照细胞株4T1-control.
四、定量PCR和免疫印迹分析 五、MTT法检测细胞增殖活性:分别将对数生长期的３组
乳腺癌细胞4T1-Control,4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt12用0.25%胰酶消化,DMEM配制成单细胞悬液,接种于96 孔板中,每组６孔,每孔约1×104个细胞，体积100μ l, 置于5%CO2,37℃培养48h。每孔加入20μ l MTT溶液 (5mg/ml),37℃孵育4h,吸出培养基上清，150μ lDMSO 充分溶解。酶标仪测定吸光度(A)(测定波长570nm，参 比波长630nm)实验重复３次。
六、Transwell法测定细胞迁移力
实验中采用6.5mm直径,10μ m厚度,8μ m孔径的 聚碳酸酯多孔滤膜。取对数生长期细胞，胰酶EDTA消化收集细胞，离心(1000r/minx5min)弃上 清,血清DMEM洗涤１次，加入无血清DMEM，细胞 计数，用无血清培养基重悬细胞至5x105个细胞 /ml；上室每孔加入10μ l细胞悬液,下腔室中加 入600μ l含Fn的培养基,37℃培养箱中培养24ｈ ；取出Transwell并用PBS洗３次，5%戊二醛4℃ 固定0.5h；PBS洗３遍，加入结晶紫(0.1％)室温 染色0.5h；PBS洗３遍，用脱脂棉擦去上表面细 胞，显微镜下观察，取５个视野照相，计数记录 。实验重复至少３次，结果相似。