1、细胞凋亡的形态学、生化改变？P14（一）细胞凋亡的形态学改变细胞凋亡的形态学改变是多阶段的。

发生凋亡的细胞，形态上首先变圆，并逐步与周围细胞脱离，表面微绒毛消失。

胞浆凝缩，胞膜迅速发生空泡化（blebbing），细胞体积逐渐缩小，出现固缩(condensation)。

然后内质网变疏松并与胞膜融合，形成膜表面的芽状突起，称为出芽（budding）。

晚期核质高度浓缩融合成团，染色质集中分布在核膜的边缘，呈新月形或马蹄形分布，称为染色质边集(margination)。

胞膜皱缩内陷，分割包裹胞浆，形成泡状小体称为凋亡小体(apoptosis body)，这是凋亡细胞特征性的形态学改变。

凋亡小体形成后迅即被周围具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解（图8-2）。

整个凋亡过程中胞膜保持完整，没有细胞内容物的外漏，因而不伴有局部的炎症反应。

图2-2 细胞凋亡与坏死的比较（二）细胞凋亡的生化改变细胞凋亡过程中可出现各种生化改变，其中DNA的片段化断裂及蛋白质的降解尤为重要。

1.DNA的片段化细胞凋亡时DNA链的断裂有三种方式。

最多见的一种断裂方式是核小体间DNA链断裂，是内源性核酸内切酶（endogenous nuclease)被激活所致。

组成染色质的基本结构单位是核小体，核小体之间的连接区易受内切酶的攻击而发生断裂。

DNA链上每隔200个核苷酸就有1个核小体，当内切酶在核小体连接区切开DNA时，即可形成180～200bp 或其整倍数的片段。

这些片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的“梯”状（ladder pattern）条带，这是判断凋亡发生的客观指标之一。

因此，DNA片段化断裂是细胞凋亡的关键性结局。

2.内源性核酸内切酶激活及其作用在细胞凋亡过程中执行染色质DNA切割任务的是内源性核酸内切酶，这导致DNA断裂成核小体倍数大小的片段，在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的阶梯状DNA 区带。

内源性核酸内切酶多数为Ca2+/Mg2+依赖的，但Zn2+可抑制其活性。

3.Caspases的激活及其作用Caspases是目前研究得最清楚的细胞凋亡执行者。

这是一组对底物门冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶，全名为含半胱氨酸的门冬氨酸特异蛋白酶。

目前已发现该蛋白酶家族有10多个成员，第一个被发现的caspase是ICE(interleukin-Iβconverting enzyme,ICE)，即caspase-1，随后又发现了一系列的caspase，曾被分别给予了不同的名称，现统称为caspases，而以序号区分。

Caspase在凋亡中所起的主要作用是：灭活细胞凋亡的抑制物（如Bcl-2）；直接作用于细胞结构并使之解体，促使凋亡小体形成；在凋亡级联反应（cascade）中水解相关活性蛋白，从而使该蛋白获得或丧失某种生物学功能如：caspase-9可使caspase-3酶原水解形成具有分解蛋白质活性的caspase-3。

2、细胞凋亡信号转导的几条通路？特点？细胞凋亡信号的转导大多数情况下，来自于细胞外的细胞凋亡诱导因素作用于细胞后可转化为细胞凋亡信号，并通过胞内不同的信号转导途径，最终激活细胞死亡程序，导致细胞凋亡。

因此，凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。

这个系统的特点是：①多样性即不同种类的细胞有不同的信号转导系统；②耦联性即死亡信号的转导系统与细胞增殖、分化过程中的信号转导系统在某些环节上有交叉、耦联；因此同一个信号，在不同条件下既可引起凋亡，也可刺激增殖；③同一性即不同的凋亡诱导因素可以通过同一信号转导系统触发细胞凋亡。

这就意味着切断某一信号转导系统,就有可能影响多种凋亡诱导因素引起的细胞凋亡；④多途性即同一凋亡诱导因素可经过多条信号转导途径触发凋亡。

要完全阻抑某一凋亡诱导因素的作用，就必须同时切断多条相关的信号转导途径。

通路：迄今为止，研究较多的信号转导系统有：①胞内Ca2+信号系统；②cAMP/ PKA信号系统；③Fas /FasL 信号系统；④神经酰胺信号系统；⑤二酰甘油／PKC信号系统；⑥酪氨酸蛋白激酶信号系统。

1.胞内Ca2+信号系统Ca2+作为细胞第二信使介导了许多重要的细胞反应，如：肌细胞收缩、免疫细胞活化及细胞增殖等。

20世纪80年代初研究糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡时发现，细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升。

用Ca2+载体A23187人为升高B淋巴细胞内Ca2+水平，可诱导B淋巴细胞凋亡；而用钙络合剂降低细胞内Ca2+水平，可阻止细胞凋亡。

因此，Ca2+在细胞凋亡中充当了传递凋亡信号的角色。

胞内Ca2+浓度上升可激活Ca2+依赖的谷氨酰胺转移酶，活化核转录因子等触发细胞凋亡。

2.cAMP/PKA信号系统cAMP是另一个重要的第二信使，它在胞内浓度的上升，可激活cAMP依赖的PKA，使其靶蛋白上某些氨基酸残基磷酸化，从而改变蛋白质的功能。

研究发现，cAMP是细胞凋亡信号，例如：用可透过胞膜的双丁酰cAMP（db cAMP）可引起培养的髓样白血病细胞或胸腺细胞发生凋亡；糖皮质激素诱导淋巴细胞凋亡也是通过激活Ca2+/钙调素信号系统，继而激活腺苷酸环化酶使胞内cAMP浓度上升，然后活化PKA引起细胞凋亡。

3.Fas /FasL信号系统Fas蛋白是细胞膜上的跨膜蛋白，属于TNF受体家族。

作为一个膜受体，Fas蛋白可以和T淋巴细胞表面的Fas配体（FasL ）结合，也可以与抗Fas的抗体结合，从而启动细胞凋亡。

在Fas蛋白所介导的细胞凋亡中其可能的信号转导机制如下：①FasL或抗Fas抗体与Fas蛋白结合，引起神经鞘磷脂酶的活性迅速上升，使神经鞘磷脂分解产生神经酰胺，神经酰胺作为第二信使激活相应的蛋白激酶，从而诱导细胞凋亡；②抗Fas抗体或TNF与Fas 蛋白结合后可激活ICE样的caspase，后者可降解H1组蛋白，使染色体松弛，DNA链舒展而暴露出核酸内切酶的酶切位点，使DNA链更容易被切割；③Fas蛋白被激活后也可以通过Ca2+信号系统传递死亡信息而导致细胞凋亡。

4.神经酰胺信号系统神经酰胺（ceramide）是神经鞘磷脂（sphingomyelin, SM）在SM酶的作用下产生的一类新型第二信使。

其生物学效应包括：诱导凋亡；抑制细胞生长；引起细胞周期阻滞，细胞周期通常被阻滞于G0/G1期。

目前证实，电离辐射、TNF-a、Fas、糖皮质激素均可通过神经酰胺信号系统诱导细胞凋亡。

5.二酰甘油／PKC信号系统二酰甘油是磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C的催化下产生的一种第二信使物质。

二酰甘油是PKC 的内源性激活物，促癌物佛波酯是PKC的外源性激活物。

研究表明：PKC由三组同工酶组成，其中PKCβ1与细胞凋亡关系密切，活化的PKCβ1可诱导u937白血病细胞发生凋亡。

抑制PKC的活性，同时也可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡。

相反PKC激动剂佛波酯可抑制某些类型的细胞凋亡，如：糖皮质激素、T细胞受体激活及IL-2撤除所引起的细胞凋亡。

这些材料提示：二酰甘油／PK C信号系统参与了细胞凋亡，起重要的调控作用。

6.酪氨酸蛋白激酶（PTK）信号系统PTK所介导的信号系统对细胞凋亡起重要的负调控作用。

一些生长因子或细胞因子（NGF、表皮生长因子、IL-3等）与其受体结合后，通过直接或间接激活PTK，然后PTK将其靶蛋白上的酪氨酸磷酸化进而使Ras蛋白激活，并通过Raf-1（cytosolic kinase）,MAPKK(丝裂原激活蛋白激酶激酶)、MAPK（丝裂原激活蛋白激酶）引起蛋白质磷酸化并产生促进细胞分化的效应，此信号途径被阻断可引起细胞凋亡。

生长因子或细胞因子撤除引起的细胞凋亡是由于PTK不能被有效激活所致。

3、细胞凋亡的线粒体通路？线粒体损伤细胞凋亡的早期就会出现线粒体内膜通透性增大，线粒体跨膜电位（△ψm）明显下降。

在毒物（如鱼藤酮、原卟啉Ⅸ、百草枯等）诱导的肝细胞凋亡、兴奋性递质（谷氨酸）诱导的神经元凋亡，必须生长因子的缺乏引起的相应细胞凋亡，糖皮质激素诱导的淋巴细胞凋亡等，皆证实了早期的线粒体△ψm的明显下降。

△ψm 的下降可能主要是由于线粒体通透性转换孔（permeability transition pore，PTP）的改变，PTP的改变使线粒体的能量代谢障碍，释放氧自由基及蛋白酶和核酸内切酶的激活剂等，进而诱发凋亡。

体内、外实验证明，阻止线粒体通透性的改变可以防止细胞凋亡，例如：用Bcl-2可以阻止细胞凋亡，在于它能升高线粒体的跨膜电位和阻止线粒体通透性改变。

目前认为，线粒体膜功能和结构上的完整性被破坏引起细胞凋亡的可能机制是（图8-3）：线粒体内、外膜之间的PTP具有调节线粒体膜通透性的作用。

正常情况下，绝大多数PTP处于关闭状态。

当线粒体△ψm在各种凋亡诱导因素作用下降低时PTP开放，导致线粒体膜通透性增大，使细胞凋亡的启动因子如：细胞色素C（Cyt.C）、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)和凋亡诱导因子（AIF）等从线粒体内释放出来。

Cyt.C与Apaf相互作用可激活caspase-9，而AIF是一种核基因组编码的，分子量为50kD的膜间蛋白，可快速激活核酸内切酶，并增强caspase-3的水解活性。

Bcl-2具有恢复△ψm和调制PTP功能的作用，因而可阻止上述凋亡启动因子从线粒体向外释放，切断了细胞凋亡级联式反应中的关键性环节，所以具有很强的抗细胞凋亡的作用。

图2-3 线粒体△ψm下降与细胞凋亡4、细胞凋亡的氧化应激？氧化应激氧自由基化学性质活泼，破坏机体正常的氧化/还原的动态平衡，造成生物大分子（核酸、蛋白质、脂质）的氧化损伤，干扰正常的生命活动，形成严重的氧化应激状态，机体氧化损伤的后果之一就是诱导细胞凋亡。

例如：各种氧化剂（如：H2O2）可直接诱导细胞凋亡，抑制超氧化物歧化酶（SOD）的活性也可诱导细胞凋亡，而使用抗氧化剂（如：Vit E、胡萝卜素等）可以阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素如TNF-α、电离辐射等所引起的细胞凋亡。

氧化应激引起细胞凋亡的可能机制是：激活P53基因、消耗大量ATP、生物膜脂质过氧化、激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶、活化核转录因子NF-κB，AP-1等诱发细胞凋亡。

5、粘附分子定义、结构、分类、相应配体、活性如何调节？一、概念英文：adhesion molecule, AM同义词：细胞粘附分子（cell adhesion molecule,CAM）、粘附受体指由细胞合成的，可促进细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质三间粘附的一大类分子的总称。

细胞粘附是指细胞与某一表面的粘附，这一表面可以是其他细胞、基质蛋白或是无生命的物体如留置的导管等。