酶工程复习材料1.简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析的原理和操作要点？离子交换层析原理：根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。

操作:a上样：上样体积不十分严格。

b洗脱:增加溶液的离子强度c梯度洗脱法:改变溶液的pHd再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理。

凝胶层析原理：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。

大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。

操作：a凝胶的选择和处理,根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。

将干胶悬浮于5-10倍的蒸馏水中，充分溶胀，抽气，装柱。

b柱的选择:采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。

c加样:体积不能过多，不超过凝胶床体积的5％，脱盐时可在10％左右。

d洗脱:洗脱液与平衡时用的buffer一致。

洗速不可过快，保持恒速。

e胶的保存:洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。

亲和层析原理:利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子.体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。

2.酶的分类：根据酶的化学组成可将酶分为：1.单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分；2.结合蛋白酶类（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子）全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子根据酶蛋白结构特点可将酶分为单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。

寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。

多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。

3.酶合成调节的类型诱导: 组成酶：细胞固有的酶类。

诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。

阻遏:分解代谢物阻遏和反馈阻遏4.酶合成的调节机制：1.酶合成的诱导：加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。

2.末端产物阻遏：由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。

3.分解代谢物阻遏：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。

5.酶发酵动力学：主要研究发酵过程中细胞生长速度，产物生成速度，基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。

产酶动力学：主要研究细胞产酶速度以及各种环境对产酶速度的影响规律。

分为宏观酶动力学和微观酶动力学1.细胞破碎确认： 1.直接测定破碎前后的细胞数：破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。

2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。

3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。

2.固定化酶特点：1、不溶于水:反应完成后，经过滤或离心等简单分离，就可以回收，以重复使用，降低酶制剂成本。

2、具有一定的机械强度: 可将其装成酶柱，当底物溶液缓缓流经酶柱时，就能发生酶促反应，流出液中，即含有酶促反应产物，其产物不易带杂质，收率高，易精制。

3、稳定性提高:一根酶柱往往可以连续使用数十次，而酶活力并无明显下降。

3.固定化酶的性质: 1. 稳定性2. 最适温度3、最适pH 4、底物特异性(一)稳定性：固相酶的稳定性比游离酶高，主要表现在以下几个方面。

（1）热稳定性：固定化酶热稳定性较之天然酶提高。

如氨基酸酰化酶(2) 对蛋白酶水解作用稳定性：固相酶比天然酶有更强的抵抗蛋白酶水解作用的能力。

（3) 对变性试剂作用的稳定性：固相酶对各种蛋白变性剂的稳定性，一般都比天然酶强。

(4) 保藏稳定性：固相酶比天然酶保存的时间更长。

(二)最适温度：(1) 固相酶的最适温度一般比天然酶高，个别会有所降低(2) 同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同(三)最适pH：酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适PH的因素主要有两个: (1) 载体性质对最适pH影响(2) 产物性质对最适pH影响载体性质对最适pH影响：用带负电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH 高。

用带正电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH低。

用不带电荷载体制备的固定化酶，最适pH一般不改变。

影响的原因：因为固相酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液体包围着，这层不流动液体叫做扩散层，扩散层与其周围外部溶液之间存在着杜南（Donnan）平衡效应，即若是多阴离子载体就会吸引溶液中的阳离（如H+），使其附着于载体表面，导致扩散层的H+浓度比其周围外部溶液高，于是扩散层pH值就比外部溶液pH值低。

因此，外部溶液的pH必须向碱侧偏移，才能抵消微环境作用，使固相酶达到最大效率，因此使用带负电荷的载体制备的固相酶，其最适pH比游离酶高。

反之，亦然。

（见示意图）产物性质对最适pH影响:若酶催化反应产物为酸性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适pH要高。

若酶催化反应产物为碱性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适PH要低。

若酶催化反应产物为中性时，固定化酶最适pH不变。

4.联系实验教学举例说明菌种分离的一般过程。

菌种分离的一般过程：土样的采取，预处理，培养，菌落的选择，产品的鉴定。

以枯草芽胞杆菌的分离为例：②带菌土壤的热处理：称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。

②配制分离选择培养基，灭菌备用。

③稀释制备菌液：取5支灭菌带帽15ml离心管，各加入无菌水9ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水50ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入1ml微生物悬液，混合均匀后再取1ml 到第二支试管中混合，从第二支试管中再取1ml 到第三支试管中，以此类推。

④配制斜面培养基，灭菌备用。

⑤涂布培养：取10-3、10-4、10-5、10-6稀释菌液各0.2ml，采用涂布和混合法形成8 个平板，倒置后在37℃培养24-48 小时，观察水解圈的形成，在无菌条件下将水解圈最大的菌落(水解圈/菌落最大者)转接种于斜面试管中在37℃培养。

1.酶生物合成的模式有哪些？阐述理想的酶合成模式。

酶生物合成的模式分为4种类型。

即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。

同步合成型：霉合成与细胞合成生长同步。

当细胞进入对数生长期，酶大量产生；细胞进入平衡期后酶合成停止。

其生物合成可被诱导，不受分解代谢产物和尾产物阻遏，对应的mRNA不稳定。

延续合成型：酶合成伴随着细胞生长开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可延续合成较长的一段时间。

可诱导，不受尾产物阻遏和降解代谢产物阻遏，其对应mRNA相对稳定。

中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而进入细胞平衡期之后合成终止。

受尾产物阻遏，其对应的mRNA不稳定。

滞后合成型：只有当细胞生长进入平衡期之后酶才开始回成并大量积累。

可能受分解代谢产物阻遏，阻遏解除后，酶合成开始。

其对应的mRNA稳定性高。

其中最理想的合成模式是延续合成型。

属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。

因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。

细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。

对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先进技术，选育得到优良的菌株，并通过工艺条件的优化控制，使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。

2.酶的固定化方法主要有哪些？作简单阐述将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。

制备固定化酶的方法很多，有包埋法，吸附法，共价键结合法，以及交联法等1.包埋法：将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。

操作简单，可制得较高活力的固定化酶。

2.吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法。

常用的吸附剂有活性炭，氧化铝，硅藻土，多孔陶瓷，多孔玻璃，硅胶，羧基磷灰石等.操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，可反复使用。

但酶与载体结合不太牢固易脱落3.共价键结合法：酶蛋白侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。

酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。

但制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活，且制作手续繁琐。

4.交联法：利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间、或酶与惰性蛋白间进行交联反应以制得固定化酶的方法。

常用的试剂有戊二醛，己二胺，顺丁烯二酸酐，双偶氮苯等。

其中应用最广泛的是戊二醛。

制备的固定化酶结合牢固，可长时使用.但由于交联反应较激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大3.什么是酶的体外定向进化，什么是DNA改组（DNA shuffling）所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。

DNA 改组（DNA shuffling）又称有性PCR DNA或DNA重排，是运用随机突变技术，对某种感兴趣的蛋门质或核酸进行快速的改造，并定向选择所需性质的生物分子的方法。

4.酶的非水相催化有何优点，它们的主要类型有哪些？优点：①提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续生物转化②水解酶能催化合成反应，如脂的合成和肽的合成.③可以控制由水引起的副反应④酶不溶于有机介质，易于回收再利用⑤酶的固定化简单，可以只沉积在载体表面⑥从低沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易⑦酶的热稳定比水高，而且没有微生物污染类型：⑴有机介质中的酶催化：有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。

适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。

⑵气相介质中的酶催化：酶在气相介质中进行的催化反应。

适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。

⑶超临界介质中的酶催化：酶在超临界流体中进行的催化反应。

超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。

⑷离子液介质中的酶催化：酶在离子液中进行的催化作用。

离子液是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。

酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。

5.水在酶的非水相催化中有什么作用？水的作用：⑴必需水与低水系统。