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方法:采用RT -PCR 技术从黑曲霉(Aspergillus niger )W3350中扩增出脯氨酰内肽酶(PEP )的基因,插入表达载体pET -22b (+),经Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切和DNA 序列测定验证,将正确的重组质粒转入大肠杆茵BL21(DE3)中,IPTG (终浓度1mm ol ΠL )诱导获得表达。

结果:表达产物进行超声破碎,经S DS-PAGE 电泳检测,PEP 分子质量大约为57kDa ,与理论值相符,通过酶活方法测定脯氨酰内肽酶酶活为0.656U Πml ,约是出发菌株的5倍。

结论:首次成功构建表达载体pET -PEP 并在原核细胞中表达,为进一步研究PEP 的生物学功能奠定了基础。

关键词:RT -PCR ;黑曲霉;脯氨酰内肽酶;基因表达中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2008)02-0015-03Expression of PEP of Aspergillus niger W 3350in E .coliZH OU Li -na1.2,ZH ANGLu 2,LU Fu -ping 3,W ANG X iao -juan 1,Y ANGJian -fang1(1.T ianjin K ey Lab of Industrial M icrobiology ,C ollege of Biotechnology ,T ianjin University of Science and T echnology ,T ianjin 300457,China ;2.Life Science and Engineering C ollege ,Qiqihar University ,Qiqihar 161006,China )Abstract :Objective :T o construct the prokary otic expression vector of the pET -PEP ,and identify the expressed production.Method :The PEP gene were am plified from Aspergillus niger W3350cells by RT -PCR ,and inserted into the prokary otic expression vector pET -22b (+)and veri 2fied by Eco R Ⅰand Hind Ⅲdigestion and DNA sequencing.The recombinant plasmid was expressed in E .coli BL21(DE3)by inducing of IPTG (1mm ol ΠL )and identified by S DS -PAGE.R esult :A fter s onication ,S DS -PAGE analysis indicated that the relative m olecular mass (M )of the protein was about 57kDa ,and it was equivalent to the expected value.the activity of PEP was 0.656U Πml by determination ,and it is about as five times as the original strain.Conclusion :T o construct the recombinant expression vector and to express the protein in E .coli success fully and to further the study of the biological function of PEP.K ey w ords :RT -PCR ;Aspergillus niger ;PEP ;gene expression收稿日期:2007-11-29;修回日期:2008-01-08作者简介:周丽娜(1982-),女,硕士生,3通讯作者:路福平,男,教授,博士生导师,研究方向:生物药物催化工程、药物设计与合成,E -mail :lfp @ 。

脯氨酰内肽酶(Proline specific endoprotease 简称PEP )[EC3.4.21.26]能特异性水解小分子量多肽中脯氨酸羧基端肽键,多应用于食品工业、医药领域、多肽工业等领域;同时作为一种分子生物学的工具酶,可用于蛋白质序列测定、肽谱分析、特异位点的酶切、肽段的修饰和加工等[1]。

PEP 在生物体内含量甚微,直接从组织中分离提取繁琐且低效[2],且其产量和性质也不易控制。

因此,构建和利用基因工程菌作为大规模生产该酶制剂的宿主,成为研究该酶的一种新途径,具有重要的研究价值和潜在的医用价值。

国外Y o 2shim oto T 等已经从脑膜炎脓毒黄杆菌、嗜水气单胞菌、耐热古细菌、人淋巴细胞和猪脑cDNA 库中克隆了PEP 基因[3],国内仅李民等克隆和表达了点状产气单胞菌来源的脯氨酰内肽酶基因[4]。

黑曲霉是美国食品药品管理机构认定的生物安全菌,从黑曲霉中提取脯氨酸蛋白内肽酶应用于食品药品行业安全可靠,然而,迄今为止国内还没有有关黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的报道。

本文通过RT -PCR 从黑曲霉(A .niger )W3350中扩增出PEP 的基因序列,利用表达载体pET -22b (+)构建pET -PEP 重组质粒,并在原核表达菌株BL21中进行表达,为进一步研究PEP 的生理功能和生物学意义奠定基础。

l 材料与方法1.1　材料1.1.1　实验材料:菌株E .coli DH5α、E .coli BL2l 和表达载体质粒pET -22b(+)均由本实验室保存。

1.1.2　试剂DNA 片段快速纯化回收试剂盒(博大泰克生物基因技术有限公司);RNase 酶、限制性内切酶(Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ)、T 4DNA 连接酶、T aq DNA 聚合酶(T aK aRa 公司);DNA Marker (fer 2mentas 公司);超绝UNI Q -10柱RNA 抽提试剂盒、RNA 反转录试剂盒(上海生物工程有限公司),其他试剂均为分析纯。

1.1.3　仪器:PT C -200型PCR 基因扩增仪;全自动凝胶成像仪;基因脉冲导入仪M icroPulser ;G ene S pc V 核酸测定仪;DYY-III -6B 型稳压稳流电泳仪;DY C2-24b 型电泳槽;P 型移样器;PHS -2C 型pH 计;HG 75-3电热恒温培养箱;HYG -Ⅱ型回转式恒温调速摇床;G L20A 型冷冻离心机;T C L -12台式高速冷冻离心机。

1.1.4　培养基和培养条件:大肠杆菌培养基为LB 培养基,培养温度37℃,摇床转速200r Πmin ,氨苄青霉素浓度为0.2%。

1.1.5　PCR 引物设计:根据G eneBank 中已发表脯氨酰内肽酶的基因序列,设计PCR 上游引物和下游引物,由T aK aRa 公司合成。

上游引物:5’-CCGG AATT CGG CT CG CCCCCG T CTTG T -3’(Eco R Ⅰ酶切位点);下游引物:5’-CCC AAG CTTT C AAG C AT AAT ACT CCT CC ACCC -3’(Hind Ⅲ酶切位点)。