五 、影响核酸内切限制酶活性的因素
（1）DNA的纯度 （2）DNA的甲基化程度 （3）酶切消化反应的温度 （4）DNA的分子结构 （5）星星活性
第三节
DNA聚合酶
间断(discontinuity)：在DNA的一条链上某一位置两 个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。
缺刻(nick)：某一位置上丢失了一个或几个核苷酸。
三、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段 （Klenow片段） 1、性质 它具有5’→3’聚合活性和3’→5’外 切酶活性,失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性.
四、T4噬菌体DNA聚合酶
1、性质 具有 5 ’ → 3 ’聚合酶活性及 3 ’ → 5 ’外切核酸酶活性。其 3’ →5’外切酶活性对单链 DNA的作用比对双链 DNA的作 用更强。它的外切核酸酶活性比kenow片段要强200倍。
思考题： 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）d菌株 有三种限制酶，分别怎么表示？
Hind I、HindII、HindIII
BaciUus amyloliquefaciens H Streptomyces albus I
第二节 DNA分子片段化
一、天然DNA的制备
1、天然DNA的来源 ①染色体DNA
3,5磷酸二酯键
核糖核酸酶（RNase）：
脱氧核糖核酸酶（DNase）： 核酸外切酶（exonuclease）： 核酸内切酶（endonuclease）：
限制性核酸内切酶：
二、限制性核酸内切酶的分类
主要特性 限制修饰 I 型 多功能 II 型 单功能 III 型 双功能
蛋白结构
辅助因子 识别序列 切割位点
2、用途 1 ）补平或标记限制性内切酶消化 DNA 后产生的 3 ’凹端。 2）对带有3’突出端的DNA分子进行末端标记。
五、T7噬菌体DNA聚合酶 1、性质 持续合成能力最强 3’→5’外切核酸酶活性为 klenow 片段的1000 倍 没有5’→3’外切酶活性。
平末端 粘性末端 1单位酶活性(1unit 1U)：在最适反应条件
下1小时完全切割1ugλDNA样品的酶量。 同序同裂酶(识别及酶切位点相同): 同序异裂酶(识别位点相同但酶切位点不同): 同尾酶(酶切位点不同但产生相同的粘性末 端):
酶切位点的计算：
四核苷酸识别序列：44 = 256 六核苷酸识别序列：46 = 4096 2个假设：a 随机排列；b GC含量50% 如：用BglⅡ(A/GATC/T)酶切λDNA49Kb）: 理论上的切点数： 49000/4096=12个 实际情况？
3、双酶切法
应先用需要较低盐浓度缓冲液的酶进行切割，然后调节缓冲
液的盐浓度，再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶进行切割。
如果两种限制性核酸内切酶的最适反应温度不同，则应先用 最适反应温度较低的酶进行切割，升温后再加入第二种酶进 行切割。 若两种限制性核酸内切酶的反应系统相差很大，会明显影响 双酶切结果，则可以在第一种酶切割后，经过凝胶电泳回收 需要的 DNA 片段，再选用合适的反应系统，进行第二种限制 性核酸内切酶的切割。
三、限制性核酸内切酶的命名
1973年H.Smith和D.Nathans提议 ①每一种酶都由产生并纯化生出该酶的细菌的种属名中的三个 英文字母合起来代表： 第一个字母采用细菌属名的第一个字母大写； 第二和第三个字母小写，采用细菌种名的前两个字母； 如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示，代表从 大肠杆菌中分离出的限制性内切酶。 ②第四个字母表示菌株的类型（大小写均有），如EcoR中的 R代表大肠杆菌R株。 ③如果一个菌株有几种限制酶，则在代表菌株的字母后用罗马 数字表示。
4、部分酶切
当某种限制性核酸内切酶在待切割的 DNA 分子上有多个
识别序列，并且其中一个识别序列正好在切割后需要回收待
用的DNA片段上，若完全酶切，势必将此待用的DNA片段从 中切断。在此情况下，对DNA样品进行部分酶切，经过凝胶 电泳，根据待用DNA片段的大小，可回收待用的DNA片段
5、DNA分子的限制性图谱
第二章 基因工程的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶的发现
限制 (restriction) 修饰 (modification) 限制性核酸内切酶的生物学功能：自我保护功能(只 切外来的DNA，自身DNA被甲基化后切不动)
核酸酶：水解断裂多核苷酸链的两个相邻核苷酸的
异源三聚体Leabharlann ATP,Mg2+,SAM 特异性非对称 性序列 距识别序列1kb 处随机性切割 无应用价值
同源二聚体
Mg2+
异源二聚体
ATP, Mg2+ ,SAM
特异性4-8bp旋 特异性非对称 转对称序列 性序列 识别序列内或 附近特异性切 割 应用广泛 距识别序列下 游 24-26bp 无应用价值
用途
四、限制性核酸内切酶反应
1、限制性核酸内切酶反应缓冲液
2、单酶切法

若DNA样品是环状DNA分子，完全酶切后，产 生与识别序列数（n）相同的DNA片段数，并且 DNA片段的两末端相同

若DNA样品本来就是线形 DNA片段，完全酶切
的结果，产生n＋ 1个 DNA片段数，其中有两个片 段的一端仍保留原来的末端
②病毒和噬菌体DNA
③质粒DNA
④线粒体和叶绿体DNA
2、天然DNA的提取
①准备生物材料。 ②裂解细胞。
③分离和抽提DNA。
二、DNA的纯化
琼脂糖凝胶电泳洗脱法 适用于小剂量 DNA 的纯化和酶切 DNA 片 段的回收。
三、 DNA的浓缩
乙醇沉淀法 在含一价阳离子的DNA溶液中加入2体 积的无水乙醇，使DNA沉淀（-20℃， 时间在30min以上） 通过离心收集沉淀的DNA 溶于适量的TE缓冲液或无菌水中
根据模板和作用方式的不同分为三类： （1）以DNA聚合酶I为代表的“合成型” （2）以klenow聚合酶为代表，只有聚合酶活
性和部分外切酶的活性
（3）逆转录酶类，以RNA作为聚合模板
二、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）
1、性质: ①5’→3’ DNA聚合酶活性 ②3’→5’外切核酸酶活性 ③5’→3’外切核酸酶活性