5.DNA 酶 切 位 点 没 有 甲 基 化
( 如 Dpn1) 6.DNA 位点上存在其它修饰 7.DNA 不存在该酶识别顺序
验证
二 . 如果 DNA 切割不完全？ 1. 内切酶活性下降 2. 内切酶稀释方法不正确 3.DNA 不纯，反应条件不佳 4. 内 切 酶 识 别 的 DNA 位 点 上 的 碱 基 被 甲 基 化 或 存 在其它修饰 5. 部分 DNA 溶液粘在管壁上 6. 内切酶溶液粘度大，取样不准 7. 酶切后 DNA 粘性末端退火 8. 由于反应溶液、温度使内切酶变性 9. 过度稀释使酶活性降低

应用二
利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一 个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组 大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因 外，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子， 操作区，核糖体集合位点和β-半乳糖苷酶的主要部分） 插在抑生长激素基因的旁边。由于有了lac操作子的控 制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了
限制性核酸内切酶切割原理、
方法、结果分析及应用
PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓
课堂内容回顾：
1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特 定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶，简称限制酶。 2、分类：
（根据酶的基因、蛋 白质结果、依赖的辅 助因子及DNA裂解的 特异性，将限制性内 切酶分为三种类型）
解决方法 1. 用 5-10 倍量过量消化 2. 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3. 同上 4. 同上
5. 反应前离心数秒
6. 将内切酶稀释，增大取样体积 7. 电泳前将样品置 65 ℃保温 5-10 分钟，取出 后置冰浴骤冷 8. 使用标准反应缓冲液及温度 9. 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 10. 使用最佳反应体系
通过 使 用 ( 1 5 种 ) 限 制 性 内 切 酶 酶 切 重 组质
粒，说明限制性内切酶的应用和限制性内切酶
酶切图谱分析的方法o
方法：
1.质粒的构建
采用聚合酶链反应 chainreaction ， PCR) 方法扩增出 MLCKcDNA 片段，插入质粒 pBKrsv 中，构建成 pBKrsv-MLCK 重组质粒 按 Maniatis 等方法进行。 2. 酶切、构建、片段的纯化和连接
质粒 DNA 浓度 (g/L)=AZ60Xቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ稀释度 /Z0=AZ60X5
6.重组质粒的限制性核酸内切酶酶切 取0.5ml离心管 1 5 只，分别加入质粒 2μl(2μg)，依 次 加 入 限 制性内 切 酶 Acc I、Apal I、Ava H、Bgl I、BglH、Nco I、OxanI、Puv H、PpUM I、SalI、Ssp I、
熔化后冷却至 60℃，加入3μL10g/l溴化乙锭，混匀，倒入插好梳子的模具中，凝固后放入电泳 槽中。电泳槽中加入1×TAE缓冲液。
8、电泳
取酶切产物8μl与DNA上样缓冲液2μl混匀，进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可观察
到橘红色DNA条带，结果如图
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit.
切酶切割？
1. 内切酶失活
2.DNA 不 纯 ， 含 有 SDS ， 酚 ，
EDAT 等内切酶抑制因子 3. 条件不适（试剂、温度） 4.DNA 酶 切 位 点 上 的 碱 基 被 甲基化
菌菌株
5. 换 用 不 同 切 割 非 甲 基 化 位 点 的 同 类 酶 消 化 DNA ，重新将质粒转至 dcm+,dam+ 菌株中扩增 6. 将 DNA 底物与 λ DNA 混匀进行切割验证 7. 换用其它 的酶切割 DNA 或过量 酶消化进行
在进行限制性内切酶实验时首先应进行 D N A 的 定 量 ， 1 U 酶的限制性 内切酶活性指在一定时间内 ( 60min )~ 适当温度下和建议使用的缓冲液中 , 在 50 μl 反应体系中 , 将 1 μg 底物 D N A 完全消化所需要的酶量 l 单位活性依所 用底物的不同而不同 , 使用其他底物时 , 应根据情况确定所用酶量 l 根据 本实验室的经验 , 1 μg 底物 D N A 加入 5 U 的限制性内切酶在 2h 时间内可以 酶切完全，通常延长消化。
11. 加大酶量 5-10 倍
10. 反应条件不适
11. 识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺 序
三 . 如 果 DNA 片段 数目 多于理论值？
解决方法
1. 其它内切酶污染
2. 底物中含其它 DNA 杂质
1. 用 λ DNA 作底物检查酶切结果 2. 电泳检查 DNA ，换用其它酶切 ，
纯化 DNA 片段
结果分析
限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得 的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向 ( orientation )l 在选 择限制性内切酶时 ,应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒 序列中均含有的限制性内切酶酶切位点 ,这样可保证酶切片段大小能满
足进一步分析的需要。

例如：
几种限制性内切酶的切割位点
3、同工异源酶：来源不同但能识别和切割同一位 点的酶。如：BamHⅠ和BstⅠ，XhoⅠ和Pae R7 等可以相互代替使用。 4、同尾酶：识别序列不同，但产生相同末端的限 制性内切酶。如：BamHⅠ和Sau3AⅠ等由此产生 的DNA片段可借黏性末端相互连接，操作是具有更 大的灵活性。
Ⅱ型酶：是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异位点识别和切割DNA双链，所
以通常所说的限制性内切酶就指这一类酶。 Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，其切割位点很难预测。 3、命名：
规则： 第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名 第二、三个字母（小写）：该细胞的种名 第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号 例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等
3. 重组质粒的转化
4. 重组质粒的提取 组质粒。
转化采用“热休克”法。
挑取阳性克隆，在 LB 培养基中培养，采用碱裂解法提取重
5. 定量 取 5 μLDNA 溶液用 4.5 μl去离子水稀释，用紫外分光光度计比色，读取 AZ60 和 AZ80 吸光度值，计算出 AZ60/AZ80 比值，按下列公式计算质粒 DNA 浓度 , 本 实验中质粒 DNA 浓度为 1.0g/L 。
限制性核酸内切酶的
应用
基因的定位和基因分离 DNA分子碱基序列分析 比较相关的DNA分子和遗传工程 用于DNA基因组物理图谱的组建
应用一
将水稻叶绿体的DNA，用EcoR1限制性核酸内切酶消化后， 放入含有溴化乙锭的低熔点（LMP）的1%琼脂糖凝胶中做电泳分 离。从LMP中分离出分子大小为1.8-2.5kb之间的DNA片段，再 与同样经过EcoR1限制性核制性内切酶切割并用碱性磷酸酶做了 脱磷酸化处理的pBR322质粒连接，然后将混合物转移到大肠杆 菌5346菌株，培养在氨苄青霉素选择板上，形成Ampr转化子菌 落群体。这样就构成了由EcoR 限制性核酸内切酶切割的水稻 DNA基因组库。用Ampr转化子菌落与32P放射性标记的psbA DNA 探针做菌落杂交，可以分离出其中的阳性克隆体。从这些阳性 克隆体中分离出来的重组体质粒DNA，经进一步的分析，就能测 出水稻叶绿体基因psbA的序列。
SstI、Xba I、Hind皿、EcoR I各0.5微升及相 应的 NEBuffer2μL、BSAμL、去离子水 13.5μL、 混匀、
点动离心，37 ℃ 水浴孵育2小时。
7、配置1.5％的琼脂糖凝胶 称取琼脂糖0.6g,加入 1XTAE 缓 冲 液 40 ml置 微 波 炉 中,中 火120s，
{
Ⅰ型酶：具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割 DNA。 Ⅱ型酶：是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异 位点识别和切割DNA双链，所 以通常所说的限制 性内切酶就指这一类酶。 Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，其切 割位点很难预测
Ⅰ型酶：具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割DNA。
限制性核酸内切酶切割原理
1、Ⅰ类和Ⅲ类酶： 在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于 ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
2、Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割 某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别 序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重 组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文 对称特异核苷酸序列，产生5'或3'黏性末端（也有一些产生平端或钝端）
实验中可能出现的 问题及其讨论
一 . 如 果 DNA 完 全 没 有 被 内
解决方法 1. 标准底物检测酶活性 2. 将 DNA 过柱纯化，乙醇沉淀 DNA 3. 检查反应系统是否最佳 4. 换用对 DNA 甲基化 不敏感的同 类酶酶解 ， 重新将质粒 DNA 转化至 dcm-,dam- 基因型的细
结果
重组质粒 pBKrsv-MLCK 全长 7378bp ， 通过
DNAstar 软件分析获得各酶酶切位点的信息 ，
选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质
粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点，计 算酶切后片段大小的理论值经各种限制性内切 酶酶切后，获得不同大小的片段，经电泳分析 与理论设计完全一致。