细胞膜在电镜下为厚6-10nm的薄膜,主要由 脂类和蛋白质组成。生物膜的脂类具有非级性的 尾部和极性的头部，其尾部由于疏水作用而聚集 在一起，而头部则因亲水作用而与水相接触。除 类脂外，生物膜还含有多种蛋白质，这些蛋白质 便是膜蛋白。膜蛋白表面是两性的，其疏水表面 在膜内与脂类的脂肪酸链相接触，而亲水表面则 与膜两侧的水相和脂类的极性头部基团相接触， 因此膜蛋白不溶于水溶液中。正因为膜蛋白的这 种特性，认为膜蛋白不可能结晶成三维晶体。 但米歇尔勇于向困难挑战，解决了当时膜蛋白研 究面临的最大障碍，即膜蛋白不能结晶的问题。
1925， E. Gorter F. Grendel
单分子层微团、脂双分子层和脂质体结构
生物膜脂类分子的组成和含量
总脂（%） PC PE PS 鞘磷脂 胆固醇 糖脂 其它
肝细胞
红细胞 神经髓鞘 线粒体 内质网
24
17 10 49 40
7
18 15 25 17
4
7 9 2 5
19
18 8 0 5
17
光合反应中心的分子结构
局部膜结构——微区（microdomains）


膜脂和膜蛋白分子在细胞膜上的分布并不是均一的，它们可 形成特殊的，排列有序并且相对稳定的局部膜结构——微区 （microdomains）。脂筏（lipid rafts）和小凹（caveolae， 也称为膜窖）。二者均富含鞘糖脂和胆固醇。 脂筏直径约70nm,因所含有的鞘糖脂长且饱和的脂肪酸链相对 伸展而使局部细胞膜增厚。 小凹是电镜下可观察到的膜的囊状内陷，含有特异的结构蛋 白-小凹蛋白(caveolin)。脂筏和小凹通过所聚集的多种GPI连接糖蛋白、膜受体和信号分子等，参与了跨膜信号转导、 胆固醇代谢调节和膜泡运输等多种细胞行为。
33～42 46 60 51 59 67 52 76
50～51 7.5 42 5～10 40 5～10 49 4 35 2.9 33 48 2.4 24 1～2
二、生物膜结构
生物膜是流动的脂双分子层中，镶嵌着球形的蛋白质分子——“海洋中的冰山” 脂双分子层（biolayer ）是细胞膜、细胞器膜的基本结构 5×106个脂类分子/m2 109个分子/细胞
（占膜干重的％）
Membrane types
Proteins 18
lipids 79
Carbohydrates 3
Myelin Plasma membrane Platelet Liver cell Lymphocyte cell Retinal rods Nuclear membrane Endoreticular membrane Mitochondrial outer membrane Mitochondrial inner membrane
分泌蛋白进入内质网—信号肽假说
①
② ③ ④ ⑤
⑥
当肽链合成至约70个氨基酸残基时，信号肽识别颗粒（SRP） 与信号肽、GTP及核蛋白体结合，形成核蛋白体-多肽-SRP复合 体，使肽链合成暂停。 SRP引导该复合体识别并结合内质网（ER）上的SPR受体。 核蛋白体大亚基与ER上的核蛋白体受体结合，锚定在ER上。 具有GTP酶活性的SRP水解GTP并脱离复合体，肽链合成又开始 进行。 信号肽引导后续肽链通过转位子复合物（ER上跨膜通道）进入 ER腔，并被信号肽酶（位于ER膜腔面）切除而降解。 分子伴侣HSP70促进蛋白折叠成熟。
X线光束 X线源 蛋白质晶体
散射光束
感光片
肌红蛋白结晶的X线衍射图
Dr Johann Deisenhofer University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, USA
Professor Robert Huber Max-Planck-Institut fü Biochemie, r Martinsried, FRG
23 22 3 6
7
3 28 痕量 痕量
22
14 8 21 27
信号肽 (signal peptide)
靶向输送的蛋白质中存在分选信号，主要为 N 端的特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的 适当靶部位，这一序列称为信号肽。
mRNA在多聚核糖体翻译的同时，蛋白质就插 入到内质网膜，共翻译插入（cotranslational insertion）。
线粒体蛋白 核蛋白
过氧化物体蛋白 溶酶体蛋白
信号序列决定靶向运输
•细胞核蛋白经核孔进入细胞核。 •需要核输入因子α、β和小GTP酶Ran蛋白参与。 •细胞核蛋白含有核定位序列（NLS）。NLS （4～8个氨基酸，富含 碱性氨基酸）可位于肽链的不同部位。入核后不被切除。
细胞核蛋白的靶向输送-表达蛋白的定位与功能
膜外周蛋白和内在蛋白
⑥
①
②
③ ④ ⑤ ⑦ ⑧
膜蛋白在脂双分子层上的定位 （图中1～3 为内在蛋白，4～8 为外周蛋白）
膜蛋白的拓扑学
（membrane protein topology） 膜蛋白在膜上的定位和分布、空间构象 ——蛋白质在膜上的整体取向。
膜蛋白
外周蛋白-蛋白质序列中的跨膜区段
内在蛋白
米歇尔在研究中巧妙的应用了两性小分子去污剂， 当它达到一定浓度时形成微团，可将膜蛋白的疏水部 分屏蔽起来，这样使膜蛋白在水中呈溶解状态。1977 年米歇尔正是通过这种去污剂微团的极性表面间的相 互作用得到细菌视紫红质蛋白的晶体。次年米歇尔偶 尔发现当把这种物质放在冷箱中时可形成固态的玻璃 状聚集体，他由此相信有可能获得三维晶体，经过研 究他很快证明了自已的想法。尽管为了得到更好的细 菌视紫红质的三维结晶，进行了各种尝试。
Dr Hartmut Michel Max-Planck-Institut fü Biophysik, r Frankfurt/Main, FRG
For the determination of the three-dimensional structure of a photosynthetic reaction center. 1988, Nobel Prizes in chemistry
膜 蛋 白 的 分 离 纯 化 及 功 能 研 究
二、膜蛋白纯化步骤
在制备生物膜时一般要经过动物组织选择、处理、细胞的破碎、 分级分离、标志酶选择及分析鉴定等步骤。 （一）生物膜的分离纯化 根据实验目的的不同，选择适当的种属(如大鼠、小鼠、豚鼠、 猪及牛等)及组织和器官来制备生物膜。 １．细胞的破碎 在制备生物膜时，首先是使细胞破碎。细胞破碎程度的控制是 制备生物膜的关键步骤，常用的破碎方法有研磨、匀浆、超声震荡等。 常用的水溶性介质中有蔗糖、柠檬酸溶液及甘油等。 ２．分级分离 细胞破碎后，利用离心技术使悬浮在介质中的呈颗粒状的各细 胞成分及碎片分离开来。用差速离心法分离亚细胞成分。
生物膜
Biomembrane
生物化学与分子生物学教研室
Department of Biochemistry & Molecular Biology
燕
秋
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膜组学 膜生物化学与分子生物学 膜拓扑学 膜生物物理与生物工程
《生物膜》：中国科学院杨福愉院士
2005年， 科学出版社
研究范围和意义
三、生物膜蛋白的分离纯化及鉴定

研究膜蛋白结构和功能的先决条件是获得纯的膜蛋白。 一、膜蛋白纯化中需要考虑的几个方面 (1) 抑制蛋白酶活性 大多数蛋白质的含量都很低，组织和细胞中处理过程中所释放 出来的内源性蛋白酶的降解作用，会使待纯化的蛋白产物的质和量受 到很大的影响。因此，必须尽可能地抑制蛋白酶的活性。 蛋白酶按其活性位点的功能基团可分为4大类：丝氨酸蛋白酶、 巯基蛋白酶、金属蛋白酶和酸性蛋白酶；而蛋白酶抑制剂也相应的被 分为四种： EDTA---金属蛋白酶 PMSF（苯甲基磺酰氟）、亮抑肽酶---丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶 抑肽酶---丝氨酸蛋白酶 没有一种蛋白酶抑制剂是全能的，根据样品的特点,组合应用的 蛋白酶抑制剂。
20种氨基酸从有机相转移到水相的自由能变 化；统计某一氨基酸在所有已知蛋白中出现在疏水 区的比例。 影响因素 信号肽、跨膜电位（内负）、负电磷脂（朝内）
氨基酸的嗜水值
膜蛋白结构的晶体学研究
晶体 结构基元周期性排列 方法：X线晶体学、电子晶体学、NMR
X线晶体分析 （X-ray crystallography）
线粒体蛋白的靶向输送
生物膜的蛋白质- 30% 基因组编码蛋白
外周蛋白 膜蛋 白 内在蛋白而间接的 与膜结合，结合力一般较弱，采用温和 手段就可使之与膜分离。
具有两性分子的性质，其疏水部分通常 插入脂双层的核心疏水区，而亲水部分 暴露在膜两侧的水相中。
1981年米歇尔利用分子筛层析技术首次得到了光合 反应的晶体，这一年是他一生中最快乐、最成功的一年。 他把这一研究成果投稿《自然》杂志，但被拒绝。后转 投分子生物学杂志得到发表。1982米歇尔在胡贝尔领导 的当时世界上最先进的X射线衍射实验室做报告时引起了 胡贝尔的兴趣，二人选定戴森霍弗完成紫菌光合反应中 心的X射线晶体结构分析。接受这一任务后，戴森霍弗 便全身心地投入到这项工作中，并在工作中与米歇尔结 下了深厚的友谊。1985年，戴森霍弗终于完成了整个光 合反应中心结构的测定。
信号肽的性质：
• •
由12～35个氨基酸组成，分三个区段； N端附近有带正电荷的氨基酸，称为碱性氨基 末端； • 中间为中性氨基酸组成的疏水核心区； • C端通常为小分子氨基酸（丙氨酸），可被信 号肽酶裂解，称为加工区。
信号肽的一级结构
靶向输送蛋白的信号序列或成分
分泌蛋白
内质网腔蛋白
N 端信号肽
1988年，德国三位杰出的生化学家米歇尔、 戴霍弗和胡贝尔获得了诺贝尔化学奖。他们 在光合反应中心的三维结构研究中取得了杰出 的成就。这三位科学家第一次成功地阐明了光 合反应中心—一种膜蛋白的分子结构。