2-DE使得分离分辨率大大提高，获得的信息也明 显增多，是目前电泳技术中分辨率最高、信息获得 最多的技术，常用于分析复杂样品及绘制蛋白质组 图谱，是蛋白质组学研究的核心技术
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二维电泳基本操作流程
① 样品准备 ② 等电聚焦（IEF, 第一维） ③ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE,第二维) ④ 染色 ⑤ 图像分析 ⑥ 质谱分析 ⑦ 数据库分析，鉴定蛋白
CH=CH2
CH CH2 ( CH CH2 )n
形
C=O
C=O
C NH2
成
NH
O
NH
O
凝 胶
CH2
催化剂
+ 2nCH2=CH C NH2
CH2
的
NH
NH
O
反
C=O
C=O
C NH2
应
CH=CH2
式
CH CH2 ( CH CH2 )n
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聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分子量的关系
C=2.6%
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在电场中以一定的迁移率从负极移向正极
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天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石 花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。
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D-半乳糖
3，6-脱水-L-半乳 糖
琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力 的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成 大网孔型凝胶。
稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种 蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋
白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一 个很窄的蛋白区带
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+
pH 3
+
pH 3
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+
pH 3
+
pH 3
pH 7.5 pH 7.5 pH 7.5 pH 7.5
–
pH 10
–
pH 10
–
不同的蛋白质分子，由于其侧链可解离 基团的种类和数量、分子质量、空间三 维结构都有所不同，所以：
• 等电点（pI）不同，同一pH条件，所带 电荷种类、数量不同
• 大小、形状不同
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迁移率
蛋白质分子在电场中的泳动速度常常用迁移 率来表示
定义：蛋白质分子在单位电场强度下的泳动
速度
m=
6.72cm
现有两种性质相似的组分A和B，共存同一溶液中，用薄
层色谱分离时，它们的比移值分别是0.45，0.63。欲使分
离后两斑点中心间的距离为2cm，此薄板应为多长？
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电泳
带电粒子在电场 力作用下向着所 带电荷相反的方 向泳动的现象叫 电泳。
凝胶电泳
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电泳的用途？ 2
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没通电时的变化
所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶 液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷 为零。
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引入电场时的变化
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电泳结束后的变化
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等点聚焦电泳的应用
1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽
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电泳过程中分子迁移的规律，小分子在前，大分子滞 后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
混合样品
大分子
电泳方向
电泳 带孔胶
小分子
按分子
不2020/1同0/4 分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图
大小分19离
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SDS-PAGE分类
SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连 续
凝胶浓度 /T%
分子量范围 /kDa
5
30~200
10
15~100
15
10~50
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2~15
C=5%
凝胶浓度 /T%
分子量范围 /kDa
5
60~700
10
22~280
15
10~200
20
5~150
C：Bis占两者的百分含量（交联度） T：Acr和Bis在凝胶中的总浓度
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PAGE分离蛋白质的依据
相对迁移率
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未知蛋白质样品分子量的测算
计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标 准曲线上找到对应的纵坐标，即可得该样 品的分子量。
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等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEF
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等电聚焦
等电聚焦（IEF) ：利用一种特殊的缓冲液（两性电 解质）在聚丙烯酰胺凝胶上制造一个pH梯度，电泳时， 蛋白迁移到其等电点就不带电荷而停止电泳，通过该 方法分离蛋白的方法。
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凝胶干燥器
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凝胶成像系统
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SDS－PAGE测定蛋白质 相对分子质量
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实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
剥胶与固定
染色与脱色
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实验过程流程图
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考马斯亮蓝染色法
带2020/清10/4 晰度及分辨率均较前者佳。
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聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的是平板电泳仪。装置见下图
连续(a)与不连续(b)平板凝胶电泳示意图
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电泳仪
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垂直板式电泳槽
转移电泳槽
平板式电泳槽
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双向电泳槽
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垂直柱式电泳槽（盘状电泳槽）
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课堂练习
薄层层析用硅胶，有硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、硅胶 HF360等不同标号，它们分别表示什么含义？
化合物A在薄层板上从原点迁移7.6cm，溶剂前沿距原点 距离16.2cm：
（1）计算化合物A的Rf值。 0.47
（2）在相同的薄层系统中，溶剂前沿距原点距离14.3cm，
化合物A的斑点应在此薄层板上的何处？
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- - --- - -
------
-
--
---
- -- -- - - --
-
--
-
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基本原理
SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的
氢键和疏水作用，去多肽折叠。
巯基乙醇或DTT是还原剂，能打开二硫
键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。 此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合
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结果分析
相对迁移率的计算
相对迁移率mR =蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)
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标准蛋白在SDS-凝胶上的示意图
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标准曲线的绘制
以每条Marker带的相对迁移率为横坐标， 相应分
子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。
分 子 量
切取蛋白条带或蛋白点 蛋白混合物
酶解
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多肽混合物 MS/MS 数据库比对
质谱鉴定
蛋白质1 蛋白质2 蛋白质3 。。。
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蛋白质分离首选技术：
双向凝胶电泳技术
目前唯一能分离上千种蛋白的技术
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人肾脏细胞
细胞系K562
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小鼠肝细胞
双向电泳（2-dimension Electrophoresis，2-DE） 是样品经第一向电泳后，再在垂直方向上进行第二 向其他类型电泳的电泳方式。目前的双向电泳一般 是 ： 第 一 向 为 等 电 聚 焦 （ IEF ） ， 第 二 向 为 SDSPAGE
成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个 SDS分子。
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当蛋白质的分子量在15000～200000之间时 ，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分 子量的对数呈线性关系，符合下列方程：
lgMrlgKbmK1bm
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
常数 斜率
迁移率
通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量。
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染色
•考染法 •银染法 •荧光染料法 •放射自显影
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凝胶的图像处理分析和典型流程
凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立
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相 对 分 子 量 对 数
相对迁移率
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6种蛋白质混合物的电泳结果图
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琼脂糖凝胶电泳
➢ 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依
靠无反应活性的稳定的介质—琼脂糖凝胶 和缓冲液，根据核酸分子大小不同、构型 或形状的差异，以及所带电荷的不同，可 以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此 分开。