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生物化学实验

碘价的测定(Hanus) 法三、实验原理在适当条件下,不饱和脂肪酸的不饱和键能与碘、溴或氯起加成反应。

脂肪分子中如含有不饱和脂酰基,即能吸收碘。

100g脂肪所吸收碘的克数称为碘价。

碘价的高低表示脂肪不饱和度的大小。

由于碘与脂肪的加成作用很慢,故于Hanus试剂中加入适量溴,使产生溴化碘,再与脂肪作用。

将一定量(过量)的溴化碘(Hanus试剂)与脂肪作用后,测定溴化碘剩余量,即可求得脂肪之碘价,本法的反应如下:I2+Br2-->2IBr(Hanus试剂) IBr+一CH=CH—-->—CHI—CHBr—KI+CH3COOH-->HI+CH3COOKHI+IBr-->HBr+I2I2+2Na2S2O3-->2Nal+Na2S4O6 (滴定)四、实验试剂及材料仪器1、Hanus试剂:溶13.20升华碘于1000ml冰醋酸(99.5%)内,溶时可将冰醋酸分次加入,并置水浴中加热助溶,冷后,加适当之溴(约3ml)使卤素值增高一倍。

此溶液储于棕色瓶中。

2、15%碘化钾溶液称取150g碘化钾溶于水,稀释至1000ml。

3、标准硫代硫酸钠溶液(约0.1N) 25g纯硫代硫酸钠晶体Na2S2O3.5H20溶(C·P以上规格)于经煮沸后冷却的蒸馏水中,稀释至1000ml,此溶液中可加入少量(约50mg)Na2CO3,数日后标化。

标化方法:精密称取在1200C干燥至恒重的基准重铬酸钾0.15—0.20g 2份,分别置于两个500ml碘瓶中,各加水约30ml使溶解,加入固体碘化钾2.0g及6NHCl l0 ml:混匀,塞好,置暗处3分钟,然后加入水200ml稀释,用Na2S203滴定,当溶液由棕变黄后,加淀粉液3ml,继续滴定至呈淡绿色为止,计算Na2S2O3溶液的准确浓度。

滴定的反应:K2Cr2O7+6I-+14H+—>2K++2Cr3++3I2+7H2OI2+2S2O2-—>2I-+S4O2-4、1%淀粉液五、实验方法准确称取0.2g脂肪,置于碘瓶(图5中),加10ml氯仿作溶剂,待脂肪溶解后,加入Hanus试剂20ml,(注意勿使碘液沾在瓶颈部),塞好碘瓶,轻轻摇动,摇动时亦应避免溶液溅至瓶颈部及塞上,混匀后,置暗处(或用黑布包裹碘瓶)30分钟,于另一碘瓶中置同量试剂,但不加脂肪,作空白试验。

60分钟后,先注少量15%碘化钾溶液于碘瓶口边上,将玻塞稍稍打开,使碘化钾溶液流入瓶内,并继续由瓶口边缘加入碘化钾溶液,共加20ml,再加水100ml,混匀,两个样品一起加入,终止反应。

随即用标准硫代硫酸钠溶液滴定。

初加硫代硫酸钠溶液时可较快,俟瓶内液体呈淡黄色时。

加淀粉液1ml,继续滴定,滴定将近终点时(蓝色已淡),可加塞振荡,使与溶于氯仿中之碘完全作用,继续滴定至蓝色恰恰消失为止,记录所用硫代硫酸钠溶液量,用同法滴定空白管。

按下式计算碘价: 碘价=10010009.126)(⨯⨯-)脂肪重量(g N S B式中 B :滴定空白所耗Na 2S 2O 3溶液毫升数;S :滴定样品所耗Na 2S 2O 3溶液毫升 N : Na 2S 2O 3溶液的当量浓度。

七、实验注意事项1、油脂加入Hanus 试剂后,要将碘瓶的塞子塞好,防止碘挥发,同时在塞子的周围滴上几滴KI ,以便将塞子密封,碘瓶一定要放在暗处。

2、在向碘瓶中加KI 和水时,一定要先加在塞子的周围,然后打开塞子,使其进入碘瓶中。

3、在进行Na 2S 2O 3滴定时,开始不要加淀粉指示剂,当滴定到颜色变为浅黄色是再加淀粉,当滴定快到终点时,要用力摇碘瓶中的溶液,以便溶解在氯肪中的碘重新溶解在溶液中,否则滴定结果不够准确。

4、本实验需要做样品的两个平行实验,一个空白实验。

五、思考题1.测定碘值有何意义?在一定条件下,每100g 脂肪所吸收的碘的克数称为该脂肪的“碘值”。

碘值越高,表明不饱和脂肪酸的含量越高,它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。

2.加入IBr 后,为何要在暗处放置?在进行碘值测定过程中需要将其放在暗处,目的是为了防止IBr 见光分解。

3.滴定过程中,为何淀粉溶液不能过早加入?淀粉的螺旋腔可以结合碘,从而使滴定结果变的不准确。

酪蛋白的制备二、原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为35g/L。

酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物,等电点为4.7。

利用等电点时溶解度最低的原理,将牛乳的pH调至4.7时,酪蛋白就沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

三、材料、试剂与器具(一)材料:新鲜牛奶(一)试剂1、95%乙醇1 200mL2、无水乙醚1 200mL3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液100ml 先配A液与B液A液:0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O 54.44g,定容至2000ml。

B液:0.2mol/L醋酸溶液,称优纯醋酸(含量大于99.8%)12.0g定容至1000ml。

取A液1770ml,B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。

4、乙醇——乙醚混合液乙醇:乙醚=1 :1(V/V)(二)器具1、离心机2、抽滤装置3、精密pH试纸或酸度计4、电炉5、烧杯6、温度计四、操作步骤(一)酪蛋白的粗提100mL牛奶加热至40℃。

在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。

将上述悬浮液冷却至室温。

离心15分钟(3000 r /min)。

弃去清液,得酪蛋白粗制品。

(二)酪蛋白的纯化1、用水洗涤沉淀3次,离心10分钟(3 000r/min),弃去上清液。

2、在沉淀中加入30mL乙醇,搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。

用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。

最后用乙醚洗沉淀2次,抽干。

3、将沉淀摊开在表面上,风干;得酪蛋白纯品。

(三)准确称重,计算含量和得率。

含量:酪蛋白g/100 mL牛乳(g%)获得率=制备含量/理论含量式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。

五、注意事项1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质,故调节牛奶液的等电点一定要准确。

最好用酸度计测定。

2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂,最好在通风橱内操作。

3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品,不是纯净牛奶,所以计算时应按产品的相应指标计算。

七、思考题1、操作方法中的第二步能否用大量水洗涤?为什么?2、用乙醇、乙醇——乙醚混合液及乙醚洗涤的目的是什么?能否颠倒?答:不能,经过这个次序以后,结晶吸附的溶剂改为乙醚,乙醚沸点低,容易挥散干净,得到纯的洁净,乙醇和乙醚的溶解性能差很远,乙醇实际上介于水和有机溶剂之间,而乙醚是完全的有机溶剂,他们各自去洗涤各自能溶解的物质,从无机(水)到有机(乙醚),最后用乙醚是因为它会很快挥发掉,不留痕迹,可得到纯粹的蛋白质。

用正交法测定几种因素对酶活力的影响一.实验原理酶反应受到多种因素的影响,如底物浓度、酶浓度、温度pH 值、激活剂和抑制剂等都能影响酶反应速度。

这种多因素的试验可通过正交法即用一特制的表格——正交表来安排试验,计算和分析试验结果。

这样就能通过少量试验取得较好的效果。

实践证明正交法是一个多、快、好、省的方法,目前已广泛用于工、农、医药业生产和科学实验中。

本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度pH 值达四个因素对酶活性的影响,并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和PH 值时酶的活性最大。

通过本实验初步掌握正交法的使用。

二.试剂1 .2 %血红蛋白液:于20ml 蒸馏水中加入血红蛋白2.2 g ;尿素36 g ,lmol/L NaOH 溶液8 ml ,室温放1 小时,使蛋白变性。

如有不溶物,可过滤除去。

再加0.2 mol/L NaH 2 PO 4 溶液至110 ml 及尿素4 g ,调节溶液PH 达7.6 左右。

2 .15 %三氯醋酸溶液:15g 三氯醋酸溶于蒸馏水,并稀释至100 ml 。

3 .牛胰蛋白水解酶液:3mg 牛胰蛋白水解酶冷冻干粉,溶于10 ml 蒸馏水。

4 .0.lmol/L pH 7 、8 、9 巴比妥缓冲液5 .Folin- 酚试剂:基础实验中Folin- 酚试剂法测定蛋白浓度实验三.操作步骤1 .实验设计:本实验取四个因素,即底物浓度[S] 、酶浓度[E] 、温度、pH 值。

每个因素选三个水平(水平即在因素的允许变化范围内,要进行试验的“ 点” )。

按一般方法,如对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑;共需做 3 4 =81 次试验,而用正交表只需做9 次试验。

选用L 9 表(L 是正交表的代号,L 右下角的数字表示试验次数)。

L 9 表有两个特性(1 )每一列中“1”“2”“3” 这三个数字都出现三次,即它门出现的次数是相同的。

(2 )每两列的横行组成的“ 数对” 共有九个,九种不同的数对(1 , 1 ),( 1 ,2 ),(1 ,3 ),(2 ,1 ),(2 ,2 ),(2 ,3 ),(3 ,1 ),(3 ,2 ),(3 , 3 )各出现一次。

在每一列中各个不同的数字出现的次数相同;每两列的横行组成的各种不同的“ 数对” 出现的次数也都相同,这两点就是正交表的特点,它保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的,因此,分析数据比较方便,结果比较可靠。

试验时(S)是0.2ml,(E)是0.2ml,温度37℃,pH为7。

第二个试验(S)是0.2ml ,(E)是0.5 ml.温度50℃,pH为8,余此类推。

另取试管一支作非酶对照,即加 2 %血红蛋白液0.5ml ,缓冲液 2.0ml ,先加15 %TCA 2ml 摇匀放置10 分钟后再加入酶液0.5ml 。

将上述酶促和非酶对照各管反应液,室温放置15 分钟,过滤,滤液留待Folin- 酚法测定酶活力Folin- 酚法测定酶活力:取滤液0.5ml ,加入试剂A 4ml ,室温放置10 分钟,再加试剂 B 0.5ml ,30 分钟后于680nrn 测光吸收。

3 、数据记录及分析:实验做好后,把9 个数据填入分析表的试验结果栏内,按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水下试验结果总和,再取平均值(各自被 3 除)。

最后计算极差。

极差是指这一列中最好与最坏的之差,从极差的大小就可以看出那个因素对酶活力影响最大,那个影响最小。

找出在何种条件下酶活力最高。

最后作一直观分析的结论以 A 值(I/3 ,II/3 ,III/3 )为纵坐标,因素的水平数为横坐标作图。

四.思考题1.正交试验的优点有哪些?①实用上按表格安排试验,使用方便;②布点均衡、试验次数较少;③特别在只有一两个因素起主要作用时,正交试验法能保证主要因素的各种可能都不会漏掉。

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