根据糖碳源的利用分類
API50 CHL
往基础培养基里放入分离菌并混匀 ↓ 分注、 向No.1～50分注、培养 ～3天 ～ 分注 培养2～ 天 ↓ 变成黄色⇒可利用碳源⇒ 变成黄色⇒可利用碳源⇒判定菌种
在No.1～50的 各试管中装有 不同种类的糖。
Streptococcus thermophilus
益生菌的想法
Fuller博士（1989） 改善肠道的细菌比例、 改善肠道的细菌比例、给与人体有益的影响 人类能够食用的、活着的微生物。 人类能够食用的、活着的微生物。 关注着存在于肠道内的乳酸菌及双岐菌。 注着存在于肠道内的乳酸菌及双岐菌。 用有益菌抑制有害菌。 用有益菌抑制有害菌。 抑制有害菌 予防医学的 用药剂有益菌和有害菌都杀死了。 Antibiotics 用药剂有益菌和有害菌都杀死了。 治療医学的 （抗菌素） Probiotics
泡菜
面包起子 Lactobacillus sanfrancisco
糞便
Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum Enterococcus faecalis,
肠道菌分离的问题点
• 双岐杆菌・嗜酸乳杆菌 双岐杆 ⇒在肠道易生存的乳酸菌 从糞便分离菌
乳酸菌和健康
1
不老長寿说 Metinicof 博士 (1845-1916) 的不老長寿说 老化的原因是肠道菌的毒素吗? 老化的原因是肠道菌的毒素吗? 常喝酸牛奶的保加利亚长寿人很多。 常喝酸牛奶的保加利亚长寿人很多。 为清除肠道有害菌、 为清除肠道有害菌、 奶中活着的乳酸菌有效 有效吗 酸牛奶中活着的乳酸菌有效吗?
因为双岐杆菌厌氧、 因为双岐杆菌厌氧、 注意尽快地 厌氧培养。 厌氧培养
使用器具的处理
将使用完了的一次性塑料器具 放入灭菌袋， 放入灭菌袋， 高压蒸汽灭菌处理后扔掉 处理后扔掉。 高压蒸汽灭菌处理后扔掉。 玻璃器具等。 玻璃器具等。 用１％的次氯酸溶液 消毒一晚后洗净
菌分离的实例
（光冈知足博士的「肠道菌的世界」）
改良LBS琼脂培养基 改良LBS琼脂培养基 LBS 肠道乳酸杆菌用） （肠道乳酸杆菌用）
LBS琼脂培养基（BBL）84g Lab-lemco powder 8g Sodium acetate 3H2O 7.5g 蒸溜水 1L 溶解后95℃、30分加热、 冷却到50℃。 加入3.
成功
失败 反复分离到单菌株为止。 反复分离到单菌株为止。 即使一次成功， 即使一次成功， 为确认再做一次。 为确认再做一次
单株菌分离的实例
（从酸奶分离出）
从酸牛奶、使用一般的 乳酸菌分离培养基分离的
从左侧的培养基 使用MRS培养基分离的
菌的显微镜观察
Lb. bulgaricus
St. thermophilus
（发生气泡 发生气泡） 发生气泡
阴性
阳性
乳酸菌的分类命名 乳酸菌的分类命名
学名 Streptococccus thermophilus （subsp.OOOO) SBTOOOO 属 种 （亚种） 亚种） 株
代表的乳酸菌属和对食品的应用
Lactococcus Streptococcus Lactobacillus Leuconostoc Pediococcus 乳球菌属 链菌属 链菌属 乳杆菌属 明串珠菌属 明串珠菌属 片球菌 片球菌属 干酪 酸奶 酸奶、 酸奶、泡菜 干酪 泡菜
TOSTOS-丙酸琼脂培养基
（双岐杆菌用） 双岐杆菌用） TOS-丙酸-琼脂培养基 62.5g 蒸溜水 1L 115℃、15分灭菌后、 向平皿分注平板。 混匀培养时、冷却到50℃、 和样品混合。
样品的厌氧培养
往密封的容器里放入 脱氧剂和氧检验剂， 脱氧剂和氧检验剂， 37℃培养约 培养约3 37℃培养约3天。
① ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ② ⑧ ③ ⑨ ④ ⑨ 均质机 稀释用水 分离培养基 各种吸管 Teflon制的均质器具 各种厌氧培养器具 消毒用酒精 消毒用次氯酸 消毒用次氯酸 防止污染用罩布
⑤ ⑧ ⑦ ⑥
其它、煤气喷灯、 其它、煤气喷灯、试管搅拌机 灭菌用塑料袋、手套、 灭菌用塑料袋、手套、口罩
代表的益生菌代表的益生菌 1
肠道乳杆菌・・・Lactobacillus属 肠道乳杆菌
gasseri, acidophilus, casei, reuteri, johnsonii… ・主要在小肠内 ・使奶发酵的能力弱 ⇒需要促进发酵的酵母精等 ・与普通的乳酸菌相比、
（L.bulgaricus S.thermophilus）
肠
酸 酸
乳酸菌的分離
出售的冻干菌（粉末） 出售的冻干菌（粉末） 冻干菌 • 优点:轻便、安全、放心 优点:轻便、安全、 • 缺点:价格高、无个性、新产品开发难 缺点:价格高、无个性、
・独自菌株的分离
⇒ 具有个性、能制作出多样的产品、 具有个性、能制作出多样的产品、 通过研究能找到独特的生理效果 有必要继代培养。需要菌的培养技术。 有必要继代培养。需要菌的培养技术。
Bifidobacterium longum
菌
活着到达肠道
109
嗜酸乳杆菌
109
嗜酸乳杆菌
活 菌 数
108 10
7
活
双岐杆菌
108 107
菌 数
乳酸 菌
双岐杆菌
106 105
106 105
嗜 乳杆菌
10
4
0
1
2
3
104
0
6
12
18
処理時間（ｈｒ） 処理時間（ｈｒ）
処理時間（ｈｒ） 処理時間（ｈｒ）
L.acidophilus Bifidobacterium
有益菌、无害的菌、 有益菌、无害的菌、有害菌 100种 100兆个以上 100种、100兆个以上
大肠菌
Clostridium
.. 有益菌、无害的菌、 有益菌、无害的菌、有害菌
乳酸菌和健康
1011 1010 109
3
ビ ビ ビビ ビ 菌 双歧杆菌 大大菌
（必要的技术） 必要的技术）
・从多种菌中分离 ⇒ 必须选择培养基 双岐杆菌等、 ・双岐杆菌等、分离厌氧的菌 ⇒ 需要厌氧培养法 注意点！） （注意点！） 有可能染上粪便中的有害菌 有害菌⇒ ・有可能染上粪便中的有害菌⇒引起腹泻等 一定戴上手套、口罩等保护用具 ・一定戴上手套、口罩等保护用具
器材的准备
Lb. gasseri
Bif. longum
乳酸菌属的鉴定
分离株
产生50%以上的乳酸、革兰氏阳性、 无运动性、Catalase（－）、芽孢（－）
球菌 长链 异型发酵 Leuconostoc
杆菌
Lactobacillus 同型发酵 Streptococcus Enterococcus Lactococcus
过氧化氢酶试验（Catalase test）
・看有无过氧化氢分解酶的试验 看有无过氧化氢分解 分解酶的试验
2H2O2
（过氧化氢）
2H2O + O2↑
catalase（水）
（氧）
好氧性菌･･･有分解性（阳性） 好氧性菌･･･有分解性（阳性） ･･･有分解性 乳酸菌・・・无分解性（阴性） ・・・无分解性 乳酸菌・・・无分解性（阴性） 厌氧性菌也无分解性） （厌氧性菌也无分解性）
用Teflon均质器具均质化 Teflon均质器具均质化
糞便 1g
稀释用水 9ml
均质化
样品
糞便混浊液的制作
・取糞便约1g放入容器中。 取糞便约1g放入容器中。 1g放入容器中
・加入约9ml的稀释水。 加入约9ml的稀释水。 9ml的稀释水 ・用均质机把粪便的块 好好碾碎。 好好碾碎。 注意有害菌的感染！ 注意有害菌的感染！ ・操作者的手等没有伤口 戴手套、口罩、 ・戴手套、口罩、 眼镜等的保护用具 常备消毒药。 常备消毒药。
益生菌的基础
乳酸菌的特征 乳酸菌和 乳酸菌和健康 益生菌的特点 益生菌的特点 乳酸菌、 乳酸菌、肠道菌的分离 乳酸菌种的鉴定 菌种的保存 菌种的保存
瀬戸 泰幸
雪印乳业(日本) 雪印乳业(日本) 技术研究所 研究员 短期专家） （日本国际协力机构 短期专家）
酸奶的起源
酸奶的历史和家畜饲养一样久远 牛 羊・山羊 公元前１ 公元前１万年 地中海东部地区 公元前７千年 美索不达米亚北部 公元前７
大肠菌 ブ ブブ 状状菌 葡萄球菌 乳酸杆菌 乳乳乳菌
证明肠道乳酸菌及双岐菌守卫人类的健康
菌 数
10
8
107 106 105 104 103 102 0 1 2 3 4 5 6 7
Clostridium ク ク ビ クク クブ ク
梭状芽孢杆菌
日日 从出生到出生后第7 新生儿的粪便菌丛 从出生到出生后第7天
我们知道保加利亚乳杆菌在肠道内是死绝的、 我们知道保加利亚乳杆菌在肠道内是死绝的、 博士的学说被遗忘了。 Metinicof 博士的学说被遗忘了。
乳酸菌和健康
2
之后的研究、知道了在肠道内也有乳酸菌的存在、 之后的研究、知道了在肠道内也有乳酸菌的存在、 由有害菌占据着。 由有害菌占据着
胃 小肠 大肠
四联 Pediococcus
乳酸菌种的鉴定
• 糖碳源的利用方法 含有各种糖的培养基培养， 用含有各种糖的培养基培养， 确认用哪种糖能使菌发育。 确认用哪种糖能使菌发育。 使用出售的检测板（ Biolog） 使用出售的检测板（API, Biolog）很方便 • 利用了DNA的方法 利用了DNA的方法 DNA 16S-rDNA排列 DNA-DNA杂交 排列、 16S-rDNA排列、DNA-DNA杂交 • 其它的 再确认、进行发酵形式、发育温度、 再确认、进行发酵形式、发育温度、 D,L乳酸比例 耐盐性等的检查。 乳酸比例、 D,L乳酸比例、耐盐性等的检查。