↓２~3周ﻫ加强免疫，剂量50～500μg为宜,iｐ或iv(静脉内注射）ﻫ↓3天后
取脾融合
目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新,如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。ﻫ(2)颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫1×107／０．5mlｉp
↓2~3周后
第二次免疫1×１07/０07/0.5ml ip或ｉｖﻫ↓ﻫ取脾融合
细胞融合ﻫ细胞融合前准备ﻫ1．骨髓瘤细胞系的选择:骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量MｃＡｂ。常用的骨髓瘤细胞系见下表。
用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系
名称
来源
耐受药物
Ig链
H L
P３/Ｘ６3-Aｇ8(Ｘ６3)
BALB/C骨髓瘤MOＰC－21
8-氮鸟嘌呤
r1K
P3/X6３-Ag8.65３(X６3-Ａg8.65３)
P３/X6３-Ａｇ8
8-氮鸟嘌呤
－ﻫ-
P３/NＳI-1-Ａg４-１（NS-１)
Ｐ３／X63-Ag8
8-氮鸟嘌呤
方法：ﻫ动物的选择与免疫
１．动物的选择ﻫ纯种BＡLB/C小鼠，较温顺,离窝的活动范围小,体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BAＬＡ/C小鼠。ﻫ2．免疫方案
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的ＭｃＡb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
制备原理ﻫ要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆Ｂ淋巴细胞，但这种Ｂ淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖,应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一,得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性,它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性,也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性,用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下:
主要仪器设备:ﻫ超净工作台、CO２恒温培养箱、超低温冰箱（-7０℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机(水平转子,4０00r/min）、３7℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括:100ml、５0ml、２５ml细胞培养瓶，10ｍl、1ml刻度吸管，试管，滴管(弯头、直头）,平皿,烧杯，５０0ml、250ｍl、100ｍｌ盐水瓶,青霉素小瓶，10ml、5ml、１mｌ注射器等,9６孔、24孔细胞培养板，融合管（50mｌ圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀,眼科镊，血细胞计数板,可调微量加样器(~50ul，～200ul,~1０00ul）,弯头针头,20０目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。
(１)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～5０μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~1ml,0.2ml／点）
↓3周后
第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射）(ip剂量不宜超过０.5ｍl）ﻫ↓３周后ﻫ第三次免疫剂量同一,不加佐剂，iｐ(5～7天后采血测其效价)
－K(不分泌型)
P3/X６3－Ａｇ8.Ul（P3Ul)
(Ｘ６３×ＢAＬB/C脾细胞)杂交瘤
８－氮鸟嘌呤
－ﻫ-
SＰ２／０-Ag14(SP2/0)
(X6３×BAＬＢ／Ｃ脾细胞)杂交瘤
８-氮鸟嘌呤
－ﻫ－
Ｆ0
BAＬB/C骨髓瘤
8-氮鸟嘌呤
-ﻫ-
S１94／５.ＸＸO．BU.1
Ｐ3/X6３－Ag8
5-溴脱氧尿嘧啶核苷
单克隆抗体
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单克隆抗体概念和制备原理
基本概念
抗体主要由B淋巴细胞合成。每个Ｂ淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙,即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体（moｎoclonａl antiｂody,ＭcＡb)。
优点ﻫ单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点:ﻫ1.单一特异性,与一个抗原决定簇反应；ﻫ2.可重复性,能够提供完全一样的抗体制剂;
３.一经制出,可无限量地供应；
４.生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原;
5.能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。
单克隆抗体制备方法
１９７5年Kohleｒ和Milsｔｅｉn发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交瘤细胞既可产生抗体,又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。ﻫ采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤。
在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理,目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳,而且操作简便。ﻫ（1）二氧化硅吸附法:ﻫ新鲜采集的腹水(或冻存的腹水）,200０r/min15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入ＰH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol／Ｌ巴比妥,0.１5ｍoｌ/LＮａCl，0.8ｍｍoｌ/L Mg2+,0．3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ｍｌ稀释腹水中加150ｍg二氧化硅粉末,混匀，悬液在室温孵育３0分钟,不时摇动;２０00ｇ离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。ﻫ(２)过滤离心法:ﻫ用微孔滤膜过滤腹水,以除去较大的凝块及脂肪滴；用1000０g15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。ﻫ(3)混合法：ﻫ即上述两法的组合,先将腹水高速离心,取上清液再用二氧化硅吸附处理。ﻫ2． 单抗的粗提ﻫ（1）硫酸铵沉淀法
-
－
ＭPC11－４5.6TＧ1．7
BALB/C骨髓瘤MPＣ-11
6-巯鸟嘌呤
r2bK
21０.RCY３.Aｇ1．2.3
LＯＵ大鼠骨髓瘤Ｒ２１0
8-氮鸟嘌呤
－Ｋ
ＧM1５00６ＴG-A12
人骨髓瘤GＭ1５0０
6-巯鸟嘌呤
r1K
U-266AR
人骨髓瘤U-２６6
8-氮鸟嘌呤
ελ
ﻬ
单克隆抗体的纯化
1．腹水型单抗的纯化