单克隆抗体的应用
检验医学诊断试剂 ① 病原微生物抗原、抗体的检测 ② 肿瘤抗原的检测 ③ 免疫细胞及其亚群的检测 ④ 激素测定 ⑤ 细胞因子的测定
肿瘤的导向治疗—生物导弹 蛋白质的分离纯化
抗 原 31 2 4
免疫
BA LB /c
1234
31 2 4
传统抗血清
所有抗体混合
B 細胞 1
3 2
4
瘤細胞
思考题
n 细胞融合技术的发展及应用进展 n 用于细胞融合的酶缺陷骨髓瘤细胞株筛选方法
2. 细胞准备
细胞融合
☆骨髓瘤细胞
•☆免选疫择脾对细数胞生长期的细胞进行传代培养 •••••••••••••☆饲细活避注存无拉无无脾计细常其饲养胞细免意于血颈菌血或数胞用中养细形胞细切清处取清淋、密小巨存-8胞0态计胞忌培死脾培巴备度鼠噬活℃浑数返过养小（养细用过腹细一或圆祖多液鼠或液胞低腔胞般液、，传洗，淋吹，不细还不氮透定代，酒巴出洗利胞有超中亮期培计精结法2于作清过～、用养数消）或细饲除23周均，，毒筛胞养死8次，-A一可备网生细亡不G、将用法长胞细处影排细研，胞理响列胞磨的2细×杂整分法作胞1交齐装游用0瘤4冻离细
（五）抗体效价的测定
1. 融合前 ELISA 效价（必须）和特异性（非必须）
2. 融合筛选时 ELISA，取样时防止污染 阳性（必须），阴性（必须），特异性 （非必须）
（六）抗体的保存
1. 同多克隆抗血清
☆56℃灭活30min，可加1/10000硫柳汞或 1/1000叠氮钠防腐
n 除菌后，4℃，3个月～半年 加甘油可延长保存期
胞的纯化
3. 细胞融合
细胞融合
• 取对数分裂期SP2/0与免疫鼠脾细胞，比例 为1:5～1:10，无血清培养基洗三次
• 1ml 50%的PEG（预温）在1分钟内滴完,静 置90秒,时间一到,将事先准备的无血清培养 液分步加入,终止PEG作用
• 加入HAT培养基（或24h后加HAT）, 分加 到96孔培养板（ 105个/孔）
食品免疫学检测技术
第四章 抗体的制备及处理
第一章 绪论 第二章 抗原 第三章 抗体
第四章 抗体的制备及处理
第五章 常见免疫学检测技术 第六章 免疫学检测技术在食品检测中的应用
第四章 抗体的制备及处理1（2学时）
l 第一节 多克隆抗体的制备 l 第二节 单克隆抗体的制备
第一节 多克隆抗体的制备
多克隆抗体(pAb)是研究和诊断领域广泛使用的 有效工具，主要用于免疫印迹、放免、ELISA、 间接和直接荧光抗体试验、红细胞凝集试验、 免疫组化、免疫沉淀试验、免疫扩散、亲和层 析、酶学以及分离基因产物等 多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的，针对某 一复杂抗原多个表位的不同抗体的混合物，又 称抗血清或免疫血清
多克隆抗体的制备
由不同B细胞克隆产生的针对抗原 上多种抗原决定簇的多种抗体混 合物
一、制备多克隆抗体的基本条件
抗原 实验动物 免疫 抗血清鉴定 抗血清收集 抗血清保存
二、多克隆抗体制备流程
（一）免疫原的制备 （二）实验动物的选择 （三）免疫的实施 （四）免疫血清的收集/采血 （五）免疫血清的鉴定/筛选 （六）免疫血清的保存
未融合的 脾细胞
骨髓瘤-骨髓 瘤杂交细胞
脾-脾杂交 细胞
四、单克隆抗体制备的流程
（一）免疫原的制备 （二）免疫的动物 （三）免疫的实施 （四）采血 （五）抗体效价的测定 （六）抗体的保存 （七）细胞融合 （八）抗体生产
（一）免疫原的制备
1. 参见第2章（抗原） 2. 制备单克隆抗体对免疫原的纯度要求不是
髓瘤细胞融合 4. 兔：兔B细胞和兔骨髓瘤细胞融合
（三）免疫的实施
1. 免疫接种时间表 2. 免疫效果
血清效价、特异性
3. 冲击/加强免疫 效价符合要求à适当休息à冲击免疫 不加佐剂 静脉à3天后融合 腹腔à4天后融合
（四）采血
☆以小鼠为例 n 效价测定
断尾采血 1大滴 n 融合前放血（阳性血清） 眼眶，0.2ml 37℃，1h，4℃过夜，离心取血清 n 对照血清
☆剂量还与抗原种类、免疫途径、免疫次 数、免疫周期等其它条件关联
（三）免疫的实施
2. 免疫途径：静脉(i. v.)、肌肉（i. m.)、皮下 （s. c.)、腹膜内（i. p.)、皮内 (i. d.) 等 ☆静脉受抗原形式、物种、注射量限制 ☆腹腔注射途径在小鼠中经常使用 ☆皮下注射途径在兔等经常使用 ☆淋巴结、脾可直接注射 ☆足垫免疫也被使用 不同注射途径比较见表：
细胞DNA合成途径及HAT筛选原理
主要途径
次黄嘌呤（H） HGPRT
氨 基酸 谷氨酰胺 尿核苷单磷酸
鸟嘌呤核苷酸 胸腺嘧啶核苷酸
替代途径
A
TK
胸腺嘧啶核苷（T）
A：氨甲喋呤，为叶酸拮抗剂 TK：胸腺嘧啶核苷激酶
HGPRT：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶
HAT作用的结果
SP2/0Байду номын сангаас 用8-AG筛选的 HGPRT- ，TK-，无限 增殖特性
（二）实验动物的选择
1. 抗原与免疫动物的亲缘关系，如兔、小 鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊、鸡等
2. 抗血清需要量 3. 动物性别、年龄
雌性攻击性小、低剂量免疫可能更敏感、 更高的循环抗体、较强的免疫反应 4. 抗原性质：蛋白质抗原对多数动物都适合 但一些特殊的如IgE对绵羊，胰岛素对家 兔，胃蛋白酶原对山羊，不易产生抗体
6. 影响细胞融合的因素
• 细胞生长状态 • 骨髓瘤和淋巴细胞比例 • PEG • 血清质量 • 细菌、霉菌、支原体等污染 • 操作手法 • 筛选时机
细胞融合
（八）抗体生产
1. 体外培养法 2. 悬动浮物培体养内诱生法
固腹相水载制体备培，养抗体浓度可达2～5mg/mL 灭菌石蜡油致敏，0.5ml/只à，1～2周后每 只小鼠腹腔注射2×106个杂交瘤细胞，7～ 10天后，当小鼠腹部膨胀且行动迟缓时抽 取腹水， 3000rpm离心10min，弃去脂 肪，收集中间澄清腹水，冻存备用
（三）免疫的实施
4. 抗原注入的体积
（四）免疫血清的收集/采血
☆及时、采前禁食24h n 颈动脉采血
家兔、山羊 n 心脏采血
豚鼠、大鼠、鸡 n 静脉多次采血
家兔耳缘静脉、山羊颈静脉
（五）免疫血清的鉴定/筛选
1. ELISA 2. 双向琼脂扩散 3. 凝集试验
（六）免疫血清的保存
☆56℃灭活30min，可加1/10000硫柳汞或 1/1000叠氮钠防腐
三、杂交瘤细胞的筛选原理（HAT筛选法）
n 细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途 径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的 合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过 程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合 成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它 是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核 苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两 种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个 效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺 乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细 胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤— 鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途 径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖 而很快死亡。唯有融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途 径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在 HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖
脾细胞: 正常细胞， HGPRT+ ，TK+ ， 5~10天自然死亡
HAT
杂交瘤细胞: 从脾细胞 获得了HGPRT+ 和 TK+，可无限增殖
8-氮鸟嘌呤筛选HGPRT缺陷株原理
n HGPRT是嘌呤核苷酸合成替代途径的关键酶， 可直接利用次黄嘌呤进行核酸的应急合成。但 HGPRT可把嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤掺入核酸中， 对细胞的核酸合成产生干扰作用
n 用于细胞融合的骨髓瘤细胞，先用8-氮鸟嘌呤的 培养基培养，正常的细胞能将8-氮鸟嘌呤掺入核 酸中而干扰核酸的合成，因此全部死亡；而少数 HGPRT缺陷型却能存活下来
n 同理，也可用5-溴-2-脱氧尿嘧啶筛选TK酶缺陷 株用于细胞融合
细胞融合的结果及命运
未融合的骨 髓瘤细胞
骨髓瘤-脾 杂交瘤细胞
（三）免疫的实施
3. 免疫间隔时间：是抗血清制备中的重要因 素，特别是首免和二免 ☆若在抗原识别阶段，B细胞正在增殖，如 过早注入抗原，可能会引起免疫抑制 ☆一般首免和二免间隔10～20天，以后间 隔7～10天 ☆免疫次数可达5～8次，半抗原可能需要 较长时间
（三）免疫的实施
4. 抗原注入的体积
（一）免疫原的制备
1. 免疫原制备方法参见第2章（抗原） 2. 制备多克隆抗体对免疫原的纯度要求十分
严格，一般要求电泳纯或层析纯。纯度越 高，特异性越好 3. 考虑抗原的大小、聚集状态及构象状态 >5kDa、小的多肽、是否天然蛋白 4. 避免细菌污染和杂质混入（如内毒素，影 响免疫应答的一些化合物）
m m
m m
细胞融合
1 23
4
阳性筛选
12 34
克隆 培养
各抗体分开
一、单克隆抗体制备的原理
抗体由B细胞合成，每个B细胞含有合成一种抗 体的基因 抗原分子上不同表位分别激活具有不同基因的B 细胞 筛选出分泌专一抗体的B细胞，克隆化培养 B细胞不能体外培养，但骨髓瘤细胞能在体外无 限增殖 应用杂交瘤技术将两者融合，得到杂交瘤细胞 杂交瘤细胞扩大培养，获得单克隆抗体