差异蛋白点过多，测序片段随机且过短，氨基酸→碱基序列简并 性过高
高通量基因芯片（诺丁汉大学—陆春贵博士）：
差异性状---基于已知序列---高通量表达差异分析---确定大量关 联基因---新基因---价格昂贵---数据分析处理复杂
图位克隆
群体至关重要---工作量超大---获得基因随机---仍是王道
RNAi能达到基因敲除的效果。
三、RNAi的作用机制
基因沉默
基因沉默分为转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene
Silencing, TGS) 和转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional
Gene Silencing, PTGS)两种：

TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因
四、RNAi研究的一般技术路线
目的基因mRNA序列分析 设计siRNA序列 正义RNA和反义RNA的合成 构建转基因载体 转入受体细胞 检测基因抑制结果
存在的问题

目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移 入体内成为RNAi应用的最大障碍； 如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为 siRNA 的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不 清楚； 目前RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的 研究报道不多。 siRNA的稳定性 在多基因家族中的非特异性问题 如何将RNAi技术运用到临床试验
• 2011年《Nature》杂志将TALEN技术列为 年度技术，2012年的《Science》杂志则将 其列入了年度十大科技突破，针对该文的 评论更是给予它基因组的巡航导弹技术的 美誉。
沉默；对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是因为基 因特异的甲基化而导致;
PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细
胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。目前普遍认为RNAi、共
抑制、quelling均属于PTGS！
dsRNA介导的同源性靶mRNA降解 过程
第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下 被RNaseⅢ特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和
上对反义RNA技术的解释正好相反
反义RNA技术
• 反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互
补的RNA分子。
• 由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异
性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制
mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方 式，最早是在 E.coli 的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现的，许多实验证明在真 核生物中也存在反义RNA。
5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶
划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦 我们不再大海捞针！！！
RNA干扰技术
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高 度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱 发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。是真核生物中存在 的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控 机制，具有重大生物学意义。 RNAi技术被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之 一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可 以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛 用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域 。 2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（Craig C. Mello） 由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。
确定基因 功能互补实验
转基因过表达、基因敲除
基因敲除专题
基因敲除概述 基因敲除(knockout)是一种遗传工程基因修 饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定 的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研 究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而 推测该基因的生物学功能。 基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基 因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中 序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替 受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整 合入受体细胞的基因组中，达到定点修饰或改造 染色体上某一基因的目的。
图位克隆策略
寻找性状差异 选择父母本 杂交-F1
或突变体
差异显著（最好其他性状差异较小） 不分离 性状分离 单粒传
自交
构建群体 表型统计
分子标记 软件分析初步定位
回交-扩大群体
SSR等
选
叠连克隆群 染色体步移
目标基因连锁的分子标记
外显子的分离、鉴定
体内蛋白水平 验证
如何获取基因
同源克隆：
已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离 ---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等
优点：简单，短平快 局限：过于简单，技术含量低，非新基因，文章水平相对较低 后续试验内容需增加
蛋白差异分析： 性状差异---双向电泳---蛋白点分离---氨基酸组成分析---序列 端部分析---DNA信息
反义RNA技术
• 根据反义RNA的作用机制可将其分为3类： • Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列(ShineDalgarno sequence）和(或)部分编码区，直接抑制 翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶 Ⅲ 降解 • Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象 变化，抑制翻译； • Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。
基因敲除的方法
同源重组敲除技术 条件性基因敲除法 诱导性基因敲除法 锌指核酸酶(ZFNs)技术 RNA干扰技术 TALEN技术 CRISPR-Cas9技术
生物学家的梦想：随心所欲地操作基因
经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。 4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target”
RISC由siRNA、解 旋酶、ATP、核酸内 切酶、核酸外切酶等 多种成分组成。
Dicer
第一步
RISC
碱基互补
酶解
第二步
RNAi的放大效应机制
• siRNA不仅可引导RISC切割靶mRNA，而且可以以siRNA 作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶 mRNA为模板合成新的dsRNA ，它在Dicer酶的作用下也 被裂解，生成大量的次级siRNA。形成一种链式反应 ，使特定的基因表达被阻止。
TALE的发现迅速成为科技最前沿
TALEN技术形成的关键研究
Sugisaki Hiroyuki 发现FokI核酸酶 （1981）
Jens Boch 破译TALE序列 （2009）
Daniel F. Voytas Adam J.Bogdanove 将TALE DNA结合motif与FokI核酸酶融 合，推出与ZFN同类型的双链DNA剪刀， 称之为TALEN。(2011)
被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象。
然而，并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。 意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因导入链孢
霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性的类
胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验中
这种共抑制现象被称为“quelling”现象。
第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA
解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱
导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，
RISC)。在ATP酶的作用下，活化的RISC以单链
siRNA为向导识别同源性的单链靶mRNA，并在距离 RISC的3’端11个碱基位置切割靶mRNA，导致靶基 因的沉默。
生命科学研究进展 基因功能研究之基因敲除技术
生物科学技术学院 郭志富 2014年11月21日
前
什么是基因？
言
为什么要研究基因？
如何研究？
原核体外表达
蛋白质功能 体外鉴定 转基因 进一步验证 表达规律-qPCR Western blotting
真核过表达 位置—分类--结构—功能 基因敲除
定量表达
反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，
siRNA）。
r
RNAi过程的功能单元：siRNA
• siRNA的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端
均有２~3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ核酸酶
称为Dicer。
19 nt duplex
2 nt 3’ overhangs
一ch Jorgensen和其同事,在对矮牵牛(petunias)进行
研究中有个奇怪的发现:将一个能产生红色素的基因置于一个强启
子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜 色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多 数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen 将这种现象命名为 共抑制现象(cosuppression), 因为导入的基因和其相似的内源基因同时都
• 这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开———华盛顿卡耐基研 究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首 次将双链dsRNA———正义链和反义链的混合物注入线虫,结果 诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义 RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫， 却能高效、特异地阻断相应基因的表达 。实际上每个细胞只要 很少几个分子的双链ＲＮＡ已经足够完全阻断同源基因的表达 。 • 后来的实验表明在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线 虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他 们将这种现象称为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。 • 并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实 是转录时污染微量dsRNA所造成的。