生物指示剂 系一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设 备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果 的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是 细菌的孢子。
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生物指示剂的形式
一定数量的孢子附着在惰性载体上， 如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品等
孢子悬浮液密封于安瓿中
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无菌保证水平
ATCC 14756
用于滤膜孔径为0.22μm 的滤器
用于滤膜孔径为0.45μm harmony 的滤器
湿热灭菌法
指将物品臵于灭菌柜内利用高压饱和蒸 汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋 白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。
• 须保证物品灭菌后的SAL≤10-6
• 对热稳定的物品，可采用过度杀灭法，
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常用的灭菌方法
湿热灭菌法 干热灭菌法 气体灭菌法 辐射灭菌法 过滤除菌法
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不同灭菌方式不同的菌种种类的选择
灭菌方法
湿热灭菌法
生物指示剂
嗜热脂肪芽孢杆菌 Bacillus stearothermophilus 生孢梭菌孢子 Clostridium sporogenes
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制药工业常用的灭菌方法
原料药： 化学合成药——较高熔点药物常用于干热灭菌法，对较低 熔点的则用湿热灭菌法 ，对不耐热药物，如是晶体，可 溶解后过滤除菌 ；
植物提取物——若是用常规或高温提取的单一成分的流浸 膏，常用压力蒸汽法、流通蒸汽法消毒灭菌；若是低温提 取物，则优先考虑过滤除菌； 生化药物——化学消毒灭菌剂，如低温乙醇法、低温间歇 法和过滤法等。
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适用范围
不耐热药物的灭菌，医疗器械、容器、高分 子材料、包装材料、生产辅助用品、不受辐射破 坏的原料药及成品等均可用本法灭菌。
ha菌孢子(Spores of Bacillus pumilus， 如NCTC 10 327、NCIMB 10 692、ATCC 27 142)。
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生物指示剂的选择
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辐射灭菌法
应用γ射线、β射线杀灭细菌的方法，又称电离 辐射，前者由钴-60或铯-137发出，穿透力强；后者 由电子加速器产生，带电荷，穿透力弱，灭菌效果 差。
γ射线灭菌机理：γ射线直接作用于微生物的蛋白 质、核酸和酶等，促使化学键断裂，杀死微生物；又可 间接作用于微生物体内的水分子，引起水的电离和激发， 生成自由基，再作用于微生物活性分子，使微生物死亡。 对于辐射灭菌，无芽孢菌比有芽孢菌敏感得多；无 芽孢菌中革兰氏阴性菌比阳性菌敏感；而病毒敏感性很 差。
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灭菌方法
孢子
生物指示剂产品
蒸汽
Smart-Read™EZTest® System （SEZS/5,SEZS/6） 嗜热脂肪芽孢杆菌 EZTest®(EZS/5,EZS/6) 孢子、生孢梭菌孢 EZTest Test Pack(STP) 子 Releasat® (RS5/100,RS6/100) SGMStrip® (SGMS, SGMD) EZTest®(EZG/6) EZTest Test Pack(ETP) Releasat® (RG/100) SGMStrip®(SGMG, SGMD) SGMStrip®(SGMLF/6)
干热法(>170℃) 射线法 环氧乙烷 某些设备、器械、耐热干粉粉剂、安瓿和西林 瓶等包装容器 耐辐射药剂、生药、包装容器等 包装材料、器械、生药等
过氧化物类(过氧化氢、 某些设备表面、工作台、器械、空气、水等 二氧化氯)
醛类(甲醛、戊二醛) 过滤除菌法 器械、工作台、包装台、空气 空气、水、不耐热液体药剂、生化药剂
SGM
灭菌方法与生物指示剂
上海汉尼生物技术有限公司 李燕燕 产品经理
概要
灭菌法和生物指示剂 生物指示剂的形式 无菌保证水平 灭菌工艺验证 常用灭菌方法 制药工业常用的灭菌方法 生物指示剂的使用 孢子数测定
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灭菌法和生物指示剂
灭菌法 系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生 物杀灭或除去，从而使物品残存活微生物的概率 下降至预期的无菌保证水平的方法。
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常用的生物指示剂
枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis， NCIMB 8058、ATCC 9372 ) D值大于1.5min
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生物指示剂的选择
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气体灭菌法
指用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物 的方法。在充有灭菌气体的高压腔室内进行。
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常用生物指示剂
枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis， NCTC 10073、NCIMB 8058、ATCC 9372 )
D值大于2.5min
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气态过氧化氢法
是利用过氧化氢在低浓度的气体状态下比液体状 态更具杀孢子能力的优点，经生成游离的-OH，用 于进攻细胞成分，包括脂类、蛋白质和DNA，达到 完全灭菌的要求的一种技术。
臵于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。
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过滤除菌法
系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理 以除去气体或液体中微生物的方法。
适用范围：
对热不稳定的药物溶液、气体、水或原料的除菌。
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常用生物指示剂
滤膜孔径为0.22μm的滤器 ：缺陷假单胞菌 (Pseudomonas diminuta, 如ATCC19 146) 滤膜孔径为0.45μm的滤器 ：黏质沙雷菌 (Serratin marcescens, 如ATCC 14 756)
辐射灭菌法
短小芽孢杆菌 Bacillus pumilus
NCTC 10327 NCIMB 10692 ATCC 27142
NCTC 10073 ATCC 9372 NCTC 10007 NCIMB 8157 ATCC 7953 12980
3kGy
短小芽孢杆菌孢子可用 于监控灭菌过程，但不 能用于灭菌辐射剂量的 建立
保藏号
NCTC 10007 NCIMB 8157 ATCC 7953 NCTC 8594 NCIMB 8053 ATCC 7955 NCIMB 8058 ATCC 9372
D值
1.5-3.0min
备注
0.4-0.8min
干热灭菌法
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis
>1.5min
去热原验证时加大肠杆 菌内毒素(Escherichia coli endoxin)
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生物指示剂的使用
选择合适的生物指示剂 正确使用生物指示剂 放臵位臵、数目、放臵的方式 使用之后的处理
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选择合适的生物指示剂
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生物指示剂的放臵位臵
应放在灭菌最困难的地方： ①在灭菌器中最大包装的中心； ②灭菌器排气口，往往不易达到灭菌温度； ③靠灭菌器的门口和底部； ④不同的生物指示剂摆放要求不同。
辐射
干热 环氧丙烷 过氧化氢 二氧化氯
短小芽孢杆菌孢子
枯草芽孢杆菌孢子 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子 枯草芽孢杆菌孢子
SGMStrip®(SGMR) DriAmp® Culturing Set(DH/50)
EZTest®(EZP/5)
Apex EZTest®(EZH/6)
SGMStrip®(SGMG, SGMD)
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应用：
隔离器的验证 新设备或灌装线的调整和认证 大型或组装设备的评估 未知气体分布动力学研究 含有多个装载配置的设备认证 设备中最难灭菌位置的日常检测
生物指示剂：嗜热脂肪芽胞杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，NCTC 10007、 NCIMB 8157、ATCC 7953 )
其SAL应≤10-12
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适用范围
药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞 以及其它遇高温和潮湿不发生变化或损坏 的物品
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常用的生物指示剂
嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，NCTC 10 007、NCIMB 8157、 ATCC 7953 ) D值为1.5～3.0min 生孢梭菌孢子(Spores of Clostridium sporogenes， NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955 ）
环氧乙烷灭菌 气态过氧化氢灭菌
气体灭菌法
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 嗜热脂肪芽孢杆菌 Bacillus stearothermophilus
>2.5min
过滤除菌法
缺陷假单胞菌 Pseudomonas diminuta
黏质沙雷菌 Serratin marcescens
ATCC 19146
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药品制剂： 输液剂和水针剂——压力蒸汽灭菌法； 热不稳定药物如冻干粉针剂——过滤法； 多数药液——射线灭菌。 软膏等半固体制剂：干热法或辐射法 中药： 大部份药材——压力蒸汽法； 除含挥发油、对热不稳定成分的药材和生、熟功效不 同的药材——热力法和辐射法。
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抗生素生产： 培养基、种子罐和发酵罐——压力蒸汽法； 无菌空气——过滤法； 最终产品——过滤法。 水和空气： 过滤法、甲醛蒸气法。 包装材料： 玻璃材质的安瓿、西林瓶——干热法； 聚乙烯、聚丙烯等塑料包装材料等——100℃蒸汽； 橡胶塞等——湿热法。
无菌保证水平 一批物品的无菌特性只能相对地通过物品中活 微生物的概率低至某个可接受水平来表述，即 SAL（sterility assurance level）。