enregistré.
膜片钳记录四种模式
全细胞记录：whole cell recording 单通道模式 cell attached 外面向外：outside out 内面向外：inside out

Patch clamp configurations
OUTSIDE-OUT
WHOLE-CELL
Structural
• Biochemistry • Molecular biology • Structural (x-ray, etc.
离子通道研究简史
1903年 Einthoven 第一份体表心电图 1952年Hodgken、Huxley 电压钳技术 枪乌贼巨突轴动作电位 1963年诺贝尔医学或生理学奖 1980－1981年 Neher、sakeman 膜片钳技术 1991年诺贝尔医学或生理学奖

膜片钳系统组成
膜片钳负反馈放大器 Data/digital
adapter 玻璃微电极操纵系统 Pclamp 软件系统：发放脉冲、采 集数据、分析数据
accueil
techniques
culture
tranches
electrodes
equipement
scellement
Les Appareils
Na+
Ca2+
Catio n
Kir 2P TTX-s TTX-r S, C, D, F A, B, E G, H, I Pacemak er
16 15 6 4 4 3 3 4
Ca2+ channel diversity
Na+ channel diversity
K+ channel diversity

细胞准备：其它来源
来源于培养细胞：直接蛋白酶消化 来源于人心肌手术标本剪刀剪碎，蛋 白酶＋胶原酶孵化

电极要求





尖端1－2μm（加热拉制） 电阻2－4欧姆（双步拉制） 尖端光滑（热抛光） 电极内充填（电极内液）细胞内液 尖端无气泡、灰尘 电极内有银丝与膜片钳系统相连接 电极由液压三维操纵器操纵（精确致μm）

Molecular diversity of voltage-dependent ion channels
Ion K+ Name Kv Eag KCNQ SK Slo Gene s 27 8 5 4 3 Physiologically defined currents Neuronal delayed rectifier; A-current Cardiac fast ‘delayed rectifier’ M-current; cardiac slow ‘delayed rectifier’ Low conductance Ca2+-dependent High conductance Ca2+- and voltagedependent Inward rectifiers, G protein-activated Leakage (resting potential) Neurons, adult skeletal muscle, glia Cardiac muscle, some sensory neurons High voltage-activated (L-type) High voltage-activated (N, P/Q, R-types) Low voltage-activated (T-type) Cardiac muscle, some neurons
Functional
• Current clamp (record membrane potential) • Voltage clamp (record ionic currents) Macroscopic 2-electrode Whole-cell patch clamp Microscopic (single channels) Cell-attached Inside-out Outside-out • Gating current • Spectroscopy
谢谢！
Human Atrial Cardiomyocyte
Human Ventricular Cardiomyocyte
Human Liver Fibroblasts
Human Aortic Endothelial Cells
[5, 13, 14]
细胞准备：来源于动物
双酶酶解分离法（胶原酶＋蛋白酶） 心脏冰盐水主动脉逆行插管 langendoff灌流装置台氏液 → 无钙台氏液→低钙胶原酶台氏液灌流 剪成1mm大小心肌碎片→蛋白酶孵化→ 过滤 冰箱保存备用（大约可成活12小时）
1 ms
K+ channel
Na+ channel
O Depolarization O Depolarization I
C
C
Voltage
Conductance
10 ms
1 ms
钾通道电流电压曲线
Current-voltage curves
i
G / Gmax 1.0 pA 15 10 5
p
I=Npi
膜片钳技术简介
丁仲如
Molecules vs. circuits
Bilayer = capacitor
Ion gradient = battery Channel = conductance
Out
GK EK
CM
In
Structure of Na+ Channel
Methods for studying ion channels
CELL-ATTACHED
INSIDE-OUT
Pull
Suction
Pull
Cell-attached patch-clamp recording
Whole-cell patch-clamp recording
单通道记录
记录单个离子通道开放或关闭 通道门控动力学分析 开放时间 概率 单通道电导测定
mV
40 ENa
Voltage
0
-40 Vrest EK GNa GK
-80 Conductance
40
mS cm2 0 Stimulus
2 ms
电压钳技术



首次记录了动作电位及离子通道电流 Hodgken－Huxley电压门控动力学模型 缺点： 双微电极，要求细胞大，细胞小不能进行 背景噪声大（1000pA） 无法记录单个离子通道（1－2pA）

电压钳技术（voltage clamp )
钳制细胞膜电位于指定水平（反馈电 路） 改变电压敏感性离子通道的开放或关 闭 欧姆定律：Im＝g×Vm 膜电导（膜对离子通透性，g） 膜电位（Vm） 膜电流（ Im)

电压钳技术
Action potential – squid giant axon
10 ms
Na+ channel
Energy levels C
2
C O I
1000 2000 1000
O I
Rate constants
C
O
10
I
C
20
O
10
I
20000
Voltage
Current through single channels
Current through many channels
液压三维操纵器
accueil
techniques
culture
tranches
electrodes
equipement
scellement
Electrodes
accueil
techniques
culture
tranches
electrodes
equipement
scellement
全细胞记录示意图

Patch clamp recording
Glass microelectrode
Suction
1 µm
"Giga-seal"
Cytoplasm
Ion channels
Cell membrane
膜片钳技术
利用一个微电极同时完成膜片或全细 胞电位的监测、钳制和膜电流的记录 通过膜电流的变化分析个体或群体离 子通道分子的电活动 精度：电流1pA（10－9A） 时间：10mS 空间：1μm
Open channel block
Closed Open Blocked
C
O OB
B
Ball-and-chain model for inactivation
Closed Open Inactivated
C
O I
膜片钳技术
要求电极与细胞良好封接 减少电极尖端与细胞膜之间产生漏流， 以减少背景噪音 措施：小膜片；电极双步拉制；尖端 热抛光； 50M欧姆 负压吸引：偶然发现，使阻抗达109欧 姆（giga seal ）
nA 15 10
K Na
0.5 50 100 -100 -50
K Na
50 100
5
-100
-50 -5 -10 -15
-5 -10 -15
-100
-50
0 mV
50
100
化学门控通道
膜片钳技术进展
与分子生物学结合研究离子通道不同 的亚基 与PCR技术结合研究单个细胞电生理及 某种表达产物的PCR研究 与绿色荧光蛋白标记显像技术结合 活体组织直接行膜片钳研究