对于石蜡切片：
1、烤片：60C 60分钟
2、脱蜡：二甲苯中I脱蜡15分钟—二甲苯H脱蜡15分钟—无水乙醇
I 5分钟
—无水乙醇H 5分钟—90%乙醇I 5分钟—90%乙醇H 5分钟—70%乙醇5分钟
—蒸馏水5分钟—蒸馏水5分钟。

3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l 柠檬酸钠，pH6.0（柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g加入1000ml蒸馏水中），上汽后加热10分钟，关火。

修复盒取出，放入装有自来水的瓷
缸中缓慢冷却至室温。

2.去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%HO2 （2ml H 202加入
18ml蒸馏水中，现配现用，避光），室温孵育10分钟，PBS洗3次, 每次5分钟。

（也可不用去除内源性酶）。

3.封闭（Blocking）
加10%E常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。

如果背景较高，可以4C封闭过夜。

不用洗，用滤纸吸干周边水分。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意
样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

4.一抗孵育（Primary antibody incubation）
参考- -抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PB）稀释一抗。

立即加入稀释好的一抗，4 C过夜，第二天取出复温45分钟。

PBS洗3次，每次5分钟。

5.二抗孵育（Secondary antibody inucubation）
按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，
立即加入稀释好的二抗，室温或4C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小
时。

PBS洗涤3次。

每次5分钟。

如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6.蛋白检测(Detection of proteins)
对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观
察。

7.复染
用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS中洗5分钟X 3次，封片(封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1:1混合) 显微镜观察，染色后为蓝色荧光。

多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。

例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186) 进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。

0.5molpH9.5碳酸缓冲液配方：
NaHC03 3.7g
Na2CO3 0.6g
双蒸水溶解至100ml，调节pH至9.5
(学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报)。