• Real-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加入荧光 基团，利用荧光信号累积实时监测和连续地分析 整个PCR进程，随着反应时间的进行，监测到的荧 光信号的变化可以绘制成一条曲线，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量的分析。
rt-qPCR实验操作
G r e e n
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位，只有和 双链DNA结合后才发出荧光，DNA双链分开就不发 出荧光，随PCR循环数的增加，产物量的增多，产生 的荧光信号逐渐增强，实现了荧光信号与产物量的关 联。
•病毒感染的定量监测
rt-qPCR实验操作
基 本 原 理•试管中进行的DNA复制反应，依据
1.DNA半保留复制的机理 2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质 •通过人为控制体外合成系统的温度，使 1.双链DNA变成单链 2.单链DNA与人工合成的引物退火 3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。
5、贴膜，离心，上机，Real Time PCR扩增结束后 输出对照组和待测组的rt-目qPCR的实验基操作 因及内参基因的CT值。
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rt-qPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差
1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rt-qPCR实验操作
荧光实时定量PCR rt-qPCR
rt-qPCR实验操作
定义 实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号的变化对PCR过程进行 实时监控，以此实现对初 始模板的定量分析。
rt-qPCR实验操作
C R 的•mRNA表达的研究 应用••微肿小 瘤残 耐留 药病 基变 因的 表检达测的研究
3、计算样本混合物（每个孔加sybr10ul、 cDNA30ug、水8.4ul-cDNA），前后引物的量（每 个孔加前后引物各0.8ul），多算1到2孔。按比例混 合样本，sybr，水。按比例混合前后引物。
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每孔18.4 微升，加完后按排板顺序加相应的前后引物混合物， 每孔1.6微升。
rt-qPCR实验操作
• 基本步骤 • 变性：加热使双链DNA变为单链（94℃，30s） • 退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链
（55℃，30s） • 延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物
为起始点的延伸反应（70~72℃，30~60s）
rt-qPCR实验操作
意 图
rt-qPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响
原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位 取
样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造 成
等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为
单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：[目的基因]-[r内t-qPC参R实验]操=作均一化的目的基因表达
•在 相 同 的 条 件 下 ， 进 行 复 制 扩 增 ， 每 扩 增
rt-qPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
rt-qPCR实验操作
步 骤
1、把要测的RNA逆转录为cDNA，决定要跑的基因 和使用的内参序列，排好板的顺序。
2、准备好DNA样本，水，sybr，前后引物，融化， 离心。
2、降低随机误差: 重复实验
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复孔
rt-qPCR实验操作
谢谢！
rt-qPCR实验操作
rt-qPCR实验操作
Байду номын сангаас
• 理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈 指数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加 倍。但随着反应循环数的增加，产物积累、原料 消耗，最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增， 而进入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只 有在指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存 在明确的数学关系（PCR产物量=初始模板量×2^N， N=循环数），因此，利用公式，可以由产物的量 精确推算出初始模板量的多少。而在线性期和平 台期，PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的 数学关系，由这两个时期的产物量来推算初始模 板量的多少是不准确的rt-qP。CR实验操作