基因工程与克隆技术考点1 基因工程1.(2015·浙江10月选考,节选)从扩大培养的大肠杆菌中提取含有目的基因的DNA,用 分别切割含目的基因的DNA 和农杆菌的Ti 质粒,然后用DNA 连接酶连接,形成重组DNA 并导入农杆菌。
2.(2016·浙江4月选考,节选)兔肝细胞中的基因E 编码代谢甲醛的酶,拟利用基因工程技术将基因E 转入矮牵牛中,以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力。
请回答:(1)从兔肝细胞中提取mRNA,在 酶的作用下形成互补DNA,然后以此DNA 为模板扩增得到基因E 。
在相关酶的作用下,将基因E 与Ti 质粒连接在一起,形成 ,再导入用氯化钙处理的 ,侵染矮牵牛叶片,将被侵染的叶片除菌后进行培养,最终得到转基因矮牵牛。
其中培养过程正确的是 (A.叶片在含合适浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织 B.愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽 C.再生的芽在细胞分裂素含量高的培养基上生根 D.愈伤组织在含合适浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株)。
(2)取转基因矮牵牛叶片,放入含MS 液体培养基和适量浓度甲醛且密封的试管中。
将试管置于 上,进行液体悬浮培养。
一段时间后测定培养基中甲醛的含量,以判断基因E 是否在转基因矮牵牛中正常表达。
培养过程中液体培养基的作用:一是提供营养;二是 ,从而使叶片保持正常的形态。
3.(2018·浙江4月选考,节选)回答与基因工程和植物克隆有关的问题:(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ酶切,在切口处形成 。
选取含抗虫基因的DNA 片段与切割后的pBI121用DNA 连接酶连接,在两个片段相邻处形成 ,获得重组质粒。
(2)已知用CaCl 2处理细菌,会改变其某些生理状态。
取CaCl 2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成 实验。
在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是 , 从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。
【考点梳理】1.基因工程的工具2.基因工程的原理与操作步骤(1)基因工程的原理①基本原理:让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。
②基本要素:多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等。
(2)基因工程的基本操作步骤3.形成重组DNA 分子(1)单酶切法（如右图）：将同一种限制性核酸内切酶切割的质粒与目的基因片段混合,加入DNA 连接酶,两两连接的产物(重组DNA 分子)有以下3种:目的基因与目的基因的连接物;质粒与质粒的连接物;目的基因与质粒的连接物。
其中,只有目的基因与质粒的连接物才是真正需要的。
(2)双酶切法双酶切法的优点主要在于防止质粒和目的基因自身环化以及保证目的基因单向插入质粒。
【自我诊断】1.转入外源基因的动物称为转基因动物。
( √)2.从猪血液中提取的胰岛素属于基因工程药物。
( ×)3.限制性核酸内切酶作用于DNA分子的氢键,使DNA双链断开。
( ×)4.限制性核酸内切酶能够特异性识别并切割烟草花叶病毒遗传物质。
( ×)5.基因工程的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶及质粒。
( ×)6.质粒中的抗生素合成基因等标记基因通常会用于含有目的基因受体细胞的筛选。
( ×)7.质粒是一种直链DNA分子,可作为基因工程中的载体。
( ×)8.DNA聚合酶和限制性核酸内切酶是基因工程中常用的两种工具酶。
( ×)9.土壤农杆菌转化法是将目的基因与农杆菌质粒重组,然后将重组DNA分子导入植物受体细胞。
( ×)10.基因工程的原理是让人们感兴趣的基因在宿主细胞中稳定的保存和表达。
( √)11.多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞是进行基因工程操作的基本要素。
( √)12.目的基因序列未知,可采用PCR扩增获得目的基因。
( ×)13.构建基因文库时需包含目的基因。
( √)14.将目的基因导入动物细胞和植物细胞最常用的方法分别是农杆菌转化法和显微注射法。
( ×)15.利用氯化钙处理农杆菌细胞,可以增加其细胞膜的通透性。
( ×)16.在宿主细胞中检测到目的基因存在,说明转基因技术操作成功。
( ×)17.限制性核酸内切酶和DNA连接酶为基因的分离和重组提供了必要手段。
( √)18.基因治疗是向目的细胞中导入正常基因以替换细胞中不正常的基因。
( ×)考向1 基因工程的工具【例1】下列关于基因工程的有关叙述,正确的是( )A.基因工程常用的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体B.一种限制性核酸内切酶能识别几种特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNAC.质粒是一种常用载体,是拟核外能自主复制的很小的环状DNA分子D.DNA连接酶可代替DNA聚合酶用于DNA的复制考向2 基因工程中形成重组DNA分子的形成方式【例2】如表所示列出了几种限制性核酸内切酶识别序列及其切割位点,图1、图2中箭头表示相关限制性核酸内切酶的酶切位点。
下列说法错误的是( )A.B.用图1中的质粒和图2中的目的基因构建重组质粒,不能使用SmaⅠ切割C.图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状,不能使用EcoRⅠD.为了获取重组质粒,最好用BamHⅠ和HindⅢ同时切割质粒和外源DNA考向3 基因工程的应用【例3】 (2018·浙江全能生9月联考)重瓣紫堇具有较高观赏和药用价值,但自然状态下几乎高度不育。
为解决重瓣紫堇的繁殖难题,科学家利用另一种植物的可育基因M,完成了对重瓣紫堇的改造,流程如图:(图中箭头指的是不同限制性核酸内切酶识别的位点)请回答:(1)在本例中,应选用的限制性核酸内切酶是,以避免质粒自身环化、错向连接等问题。
连接目的基因和质粒时,关键需要催化键的形成。
(2)导入受体细胞时,应先用CaCl2处理,使其,从而有利于重组质粒的导入。
(3)利用紫堇根尖细胞培养成完整植株,依据的原理是,理论上, (填“能”或“不能”)用紫堇的叶肉细胞代替根尖细胞完成上述改造工作。
(4)若图中所得的转基因紫堇植株自交一代,子代中能稳定遗传的个体所占的比例为。
解析:(1)根据质粒和目的基因所在DNA均存在三个限制性核酸内切酶切位点,且BalⅠ酶切位点处于目的基因M的中间,不适宜选用,因此应该选择HindⅢ和XhoⅠ进行酶切,且符合题中“避免质粒自身环化、错向连接”等问题;目的基因与质粒的连接需要DNA连接酶,具体催化的化学键是磷酸二酯键。
(2)本题采用的是农杆菌转化法,其中重组质粒首先导入的受体细胞为农杆菌,再借助农杆菌侵染植物细胞的特性,将农杆菌细胞内的目的基因转移至最终的植物细胞中,因此CaCl2处理的对象是农杆菌,其具体机理是使得细菌处于感受态。
(3)植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性,由于叶肉细胞同样具有本物种生长、发育、繁殖的全部遗传信息,所以也可作为受体细胞进行培养。
(4)该转基因植物可写作“MO”型,在自交时,相当于杂合体,会导致后代性状分离,具体为MM∶MO∶OO=1/4∶1/2∶1/4,因此可稳定遗传的植株基因型为MM,占1/4。
答案:(1)HindⅢ和XhoⅠ磷酸二酯(2)农杆菌处于感受态(3)植物细胞的全能性能基因工程中分子或个体水平的检测方法具有重要的医用价值。
如图是以基因工程技术获取重组(1)如果HSA基因序列未知,可以采用的方法获取该目的基因,为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建后才能导入宿主细胞。
(2)方框中的“?”一般选用的生物是,为了提高Ⅱ过程的导入成功率,通常用处理大肠杆菌。
(3)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择(填“Ⅰ”或“Ⅱ”)途径获取rHSA更有优势。
(4)为了鉴定宿主细胞中是否产生rHSA,可以用方法来进行检验。
A.检验HSA基因是否导入B.检验细胞中是否产生相应的mRNAC.抗原—抗体杂交D.检测是否有标记基因解析:(1)获取目的基因的方法有:从基因文库中获取、采用PCR技术扩增(适用于目的基因的核苷酸序列已知的情况下)、人工化学合成(适用于目的基因较小且序列已知的情况下)。
因此如果HSA基因序列未知,可以采用从基因文库中提取的方法获取该目的基因;为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建基因表达载体(重组DNA)后才能导入宿主细胞。
(2)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法,因此方框中的“?”一般选用的生物是农杆菌;将目的基因导入微生物细胞时常用感受态细胞法,即用氯化钙处理微生物细胞,使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态。
(3)由于大肠杆菌是原核生物,其细胞中不含内质网和高尔基体,而人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择Ⅰ途径获取rHSA更有优势。
(4)检测目的基因是否表达形成蛋白质可以采用抗原-抗体杂交法。
答案:(1)从基因文库中提取重组DNA分子(2)农杆菌氯化钙(3)Ⅰ(4)C考点2 克隆技术1.(2018·浙江4月选考,节选)取田间不同品种水稻的幼胚,先进行,然后接种到培养基中培养,幼胚发生形成愈伤组织,并进行继代培养。
用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织,再培养愈伤组织,以便获得抗虫的转基因水稻。
影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有:培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比以及(答两点即可)。
解析:组织培养时对幼胚先进行消毒处理,以免污染;幼胚经脱分化形成愈伤组织;影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素还有水稻的基因型、愈伤组织继代的次数等。
答案:消毒脱分化水稻的基因型、愈伤组织继代的次数2.(2017·浙江11月选考,节选)(1)利用植物愈伤组织获得再生植株主要有两条途径:一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和根后再形成一个完整植株的途径。
二是由愈伤组织的细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的胚胎发生途径。
另外也可不通过愈伤组织阶段而直接采用带腋芽的茎段培养成丛状苗,再诱导生根获得再生植株,其原因是腋芽中存在。
(2)利用植物克隆培育新品种,一方面可利用带有目的基因的侵染植株,若将目的基因通过的方法导入植物细胞、组织或器官获得转基因植株。
另一方面利用异源植物的进行融合产生杂种植株,或利用异源植物在试管内进行,对其产生的胚进行培养产生杂种植株。
(3)下列属于植物克隆和动物克隆共有的培养方法是。
A.悬浮培养、器官培养B.贴壁培养、传代培养C.器官培养、愈伤组织培养D.原生质体培养、传代培养解析:(1)利用愈伤组织获得再生植株,可以将愈伤组织通过器官发生途径分化成根和芽等分生组织后,获得完整植株,也可以由愈伤组织的细胞产生胚状体后再形成完整的植株。