传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶 底壁大部分 表面以前，不要急于传 代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时 间；动作要轻柔，避免损伤细胞 c 首次传代时细胞数量要多一些，使 细胞尽快适应新环境
鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白 （Glial fibrillary acid protein GFAP）
少突胶质细胞 鉴定：GalC（ß -galactosidase)
GFAP
human Schwann cells
3 神经干细胞（NSE）的培养： NSC：是可以自我更新又可分化为中枢神经系统内 所有细胞类型的具有多向分化潜能的一类细胞。 20世纪神经生物学领域的最重要进展之一就是 在脑组织等神经系统内发现了NSC，向过去几百年 来认为中枢神经系统损伤后不能再生的传统理论发 出了挑战，也使神经科学工作者从一个崭新的角度 去认识脑、认识疾病、认识人类自身；同时也为神 经变性疾病、脑缺血、脑外伤和脑肿瘤等神经系统 疾病寻求了一条新的途径 神经干细胞的来源： 胚胎干细胞；骨髓基质细胞; 成年的SVZ 和海马齿状回的颗粒细胞层
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
５ 细胞的生长过程：
原代培养：取自动物并置于体外培养中生长的细胞在传代 之前称为原代细胞或原代培养． 传代培养：当细胞持续生长到达一定密度之后，将细胞分 成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为 传代． 细胞系的生长过程： 有限细胞系： 原代培养 传代期 衰退期
ciliary neurotrophic factor/leukemia inhibitory factor/gp130 receptor
complex operates in the maintenance of mammalian forebrain neural stem cells. J Neurosci, 2001; 21(19): 7642-53.
传代培养：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的 培养瓶的过程称之为传代。
培养的方法： 1）取材 脑灰质或白质 2）洗涤 （Hanks液） 3） 移入试管吹打形成单细胞悬液
4） 静置10min 弃上层
5）过滤后收集细胞悬液，调整细胞密度 104~106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵育箱 培养 6）传代, 0.25% 胰蛋白酶消化（覆盖细胞 层即可）
聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min
3）细胞准备(大鼠神经细胞培养）：
• 新生1～3d SD大鼠，75%酒精浸泡约5min，移入超 净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于DHanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织， 放入10ml小瓶中 •剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振 摇促消化。消化约20min， •用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔 吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制 成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细胞两次，每次 10min， •吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数，
2.1 主要试剂及溶液的配制 2.1.1 无血清培养基 DMEM/F12培养基 1袋 NaHCO3 3.7g 溶于1升经高压灭菌消毒后的去离子水中， 0.22um滤膜 过滤,分装，4℃保存。使用前，加入EGF(20ng/ml)和/或 bFGF(20ng/ml) 和/或LIF、N2和鸡胚浸出液（5%）。加 50%血清和10%DMSO。 细胞消化液： 配成0.5%的胰蛋白酶(用高压的PBS)并以0.22um滤膜过 滤, 同时配成0.04%EDTA（用D-Hanks液）高压灭菌消毒 , 将两种液体以等体积混合使其终浓度为0.25%胰蛋白酶 +0.02%EDTA，分装，-20℃贮存。
无限细胞系： 滞留期 指数增长期 平台期
２０ 原 代 培 养
１８
指 数 细 胞 数 量
细胞系阶段
１６
无限细胞系
１４
１２
１０
有限细胞系
８
６
０ ２
４
６
８
１０
１２
２４
３４
４４
培养时间（周）
６ 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子；b 促生 长因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；空气=95%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L
神经元的观察：刚分离出的神经元呈圆形，
用倒置显微镜观察有明显的光晕。 •接种一般在6小时可贴壁；8小时已有纤细有 突起长出 •24小时后可见细胞体积开始增大，呈圆形或 椭圆形。生长良好的细胞可见胞体周围有明 显的光晕，立体感强，突起以单、双突起为 主 •培养至第4天，神经元胞体明显增大，形态 多样，有些具有分枝的突起， •培养7天后，神经元形态基本成熟，具有光 滑的胞体，发育良好的突起。
神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）的培养特点 呈神经球形式生长 发展史: Reynolds和 Weiss[1]在体外用表皮生长因子（ Epidermal Growth Factor, EGF）从脑组织中培养出神经 球并发现其能分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶 质细胞；将初次形成的神经球消化传代可形成二级神 经球，它们同样具有多向分化潜能；说明EGF在体外可 将NSCs维持在未分化状态并可促进其增加细胞数量。 Johe [2]和Gritti[4]则用碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor, bFGF）也同样从脑组织中获 取到呈神经球形式生长的NSCs，也可以促进这种具有 多向分化潜能的神经球在体外存活和增殖. Shimazaki的 实验证明白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）可将来自哺乳动物前脑的NSCs在体外培养条件下 维持在未分化状态增殖[3] 。
• 用含20%血清的DMEM培养基，稀释细胞制成 1×106/ml细胞悬液，接种于经聚Ｌ赖氨酸处理过的 24孔培养板（板孔放置0.8х0.8cm的小盖玻片）或培 养瓶内，放入5%CO2培养箱，37℃培养。 ４）神经元的纯化：培养两至四天后用含5~10 mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养基培养24 hour ,然后改 用常规培养液。 ５）神经元的鉴定：神经元特异性烯醇化酶 （ Neuron specific enolose NSE）、 微管相关蛋白 （Microtubule associated protein MAP2） ——神经元,
8．00 0．20
8．00 0．40
第 二节：神经细胞的培养技术

神经元的原代培养 神经胶质细胞的培养 神经干细胞的培养
一 神经元的原代培养(Primary culture) 常用试剂 1）DMEM 培养液：加10%热灭活胎牛血清，30m mol/L 葡萄糖，293.2mg/L L-谷氨酰氨，24.5m mol/L KCl， 100mU /L 胰岛素，青、链酶素各10万µ ／Ｌ，HEPES 2.8383g／Ｌ—PH 值7.2，过滤除菌，-20 ℃保存。 2） D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（ HBSS）
Reynold BA, Weiss S . Generation of neurons and astrocytes from
isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science , 1992 ,255:1707-1710. 2 Johe KK, Hazel TG, MaKay RDG, et al . Single factors direct the differentiation of stem-like cells from foetal and adult nervous system. Genes Dev, 1996; 10: 3129-3140. 1 3Shimazaki T, shingo T, weiss S. The
3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境！！ 无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、 底物、培养基等；间接接触者—配制培养 基的器皿、瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染
常用的培养用液及培养基

培养用液：水
平衡盐溶液（ＢＳＳ） 消化液１胰蛋白酶液（０．２５%） ２ 二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ） ３胶原酶
神经细胞培养
第一节：细胞培养的基本知识
1定义： 细胞培养 (cell culture)： 组织培养 (Tissue culture) ：
器官培养 ( organ culture)：
统称为体外培养 （In vitro)
2 组织或细胞培养的优点： 1）：研究对象是活细胞
2）：研究条件可以人为的控制
3）：研究的样本可以达到比较均一性 4）：研究的内容便于观察、检测和记录 5）：研究的范围比较广泛 6）：研究的费用相对比较经济 3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差 异 ；2）细胞培养存在一定的不稳定性
MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuronConfocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
取材：取3月龄Waster大鼠一只解剖显微镜下用显微手术 镊剥除脑膜及血管，分别取出海马和室管膜下区组织，置 于盛有冰冷D-Hank’s液的平皿中。 • 用双面刀片将组织切成1mm3的块状 • 组织移入已预温至37℃含有0.25%胰蛋白酶 (Trypsin) 和0.02%EDTA的10ml离心管中消化，离心5-10分钟，弃上 清，用含高糖的DMEM/F12(1:1)重悬细胞, 用300目滤网过 滤.按10%的比例加入血清，培养12-16小时或过夜。 • 更换成完全培养基（添加5%CEE、bFGF（终浓度为 20ng/ml）、EGF（终浓度为20ng/ml）、胰岛素（25g/ml ）、葡萄糖（0.6%）、HEPES（5mM）、Glutamine（ 2mM）和N2的DMEM/F12），接种后7-9天传代一次。