转染实验操作注意事项
1.进入细胞培养室前带上口罩
2.操作前用75%酒根据需要选择合适的移液枪 5.做好标记
移液枪
移液枪枪头
细胞的传代培养
传代 (passage,subculture)： 当细胞在培养容器中增殖到一定密度，生存空间及营养物质 缺乏，需按一定比例分离，接种至新的培养容器并更新培养 液，这个过程称为细胞传代。 一代: 细胞接种后到下一次传代的一段时间；可增殖几次。 培养细胞一代的三个阶段：潜伏期、指数增生期、平台期 实验研究多在指数增长期进行
转染对DNA的要求：
用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污 染，OD260/280比值应在1.8以上。
报告基因编码的蛋白质非常容易被鉴定，因此常 被用来检测目的基因表达的情况。
常用的报告基因系统: 半乳糖苷酶报告系统 荧光素酶报告系统 荧光蛋白报告系统
关于荧光蛋白
Aequorea victoria水母
残留（培养液中的血清会抑制胰酶的消化作用）。洗涤可 进行1～2次。 4．吸去PBS，加入400µl 0.125％～0.25％的胰蛋白酶，盖 上盖子，轻轻摇晃，使胰酶能均匀地作用于所有皿底的细 胞。室温或37°C放置1～2分钟，倒置显微镜下观察，当 观察到细胞收回突起变圆时立即加入800µl的含血清的新 鲜培养基（可37℃预热），终止胰酶的作用，经反复吹打， 制成细胞悬液。
5．细胞悬液制成后，即可进行传代。传代可按照1传2或者1 传3等比例进行，也可在完成计数后，按一定的细胞量进行 传代。细胞计数时，如果悬液的细胞密度过大，需先按一 定比例稀释后，再进行计数。通过细胞计数还可计算出细 胞的活力。以稀释10倍为例，取10µl细胞悬液，加入到装 有40µl PBS的Ependorf管中，再加入50µl 0.4% 台盼蓝溶 液，混匀后吸出10µl加到计数板上进行一次计数，最终的 细胞数要乘以10。另外，悬液也可收集到管中，离心后用 PBS洗涤。
/Portals/1/Pdf/tb07.pdf
肿瘤细胞株的传代
3.细胞计数 （Counting)
应用计数板或活力检测仪
• 细胞活力检测 （0.4% trypan blue 拒染）
细胞的传代和计数的实验步骤
1．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代。 2．吸去培养皿中原有的细胞培养液 3．培养皿中加入1-2 mL高压灭菌过的PBS，以洗去培养液的
血清培养液中生长的大多数细胞都能转移到 Opti-MEM中。
转染实验时间安排
第1次操作----形成DNA-脂质体复合物: 1μg DNA(3μl)加入 120μl的OMEM中，轻弹混匀，再加入3μlHilyMax脂质体，轻 弹混匀，室温放置15-25分钟。 第2次操作----复合物加入到细胞培养皿中：吸取全部复合物， 缓慢均匀滴加入培养皿，轻缓混匀。 培养箱培养，第二天中午用荧光显微镜观察转染效果。
可用于特定蛋白、各种细胞结构的标记定位。
GFP还常被用作荧光探针。利用信号转导中信号分子的迁移功能，将荧 光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子 的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。
RFP-tag
Recombinant protein
Protein1.
Protein2.
细胞转染和传代
实验目的：
理解细胞转染的原理,掌握细胞转染的操作步骤。 学习操净台内操作及注意事项 掌握贴壁细胞传代方法和细胞计数板的使用 学习荧光显微镜的结构、操作及注意事项。
关于转染（transfection）
细胞转染是指将外源的DNA，RNA等导入真核细胞 的技术，是实验室工作中经常涉及的基本方法。
贴壁细胞消化后的应用：
1. 继续传代培养 2.计数、计算细胞活力，了解细胞的生长状况。 3.制备细胞悬液，以备后期的继续实验。（重新铺板，MTT实 验；标记、流式分析、分选；爬片、免疫荧光；电转；提取 和分离；洗涤、动物注射等）。
悬浮细胞的传代：离心或更新培养液 贴壁细胞的传代：消化法（0.25%胰酶+0.66mM EDTA)
接种
贴壁 铺展
培养细胞一代的增殖过程
一定密度
体积变大、数
目增多
“汇片”
传代
潜伏期： 有活力，无增殖
指数增长期: 快速增殖， 增殖几次
平台期: 有活力，无增殖
细 胞 数 量
传代培养的实验原理:
传代培养是组织培养常规保种方法之一,也是几乎所有细 胞生物学实验的基础。传代要在严格的无菌条件下进行，每 一步都需要认真仔细的无菌操作。(本次实验因条件限制，只 能在一个模拟的环境下进行实验)
GFP-tag
带标签的重组蛋白
subcellular localization
co-localization
GFP-B23
mRFP-H2B
GFP-SENP3
RFP-B23
关于GFP载体
pEGFP-N1载体具有以下几方面特点：
①该质粒具有很强的复制能力，可以随宿主细胞分 裂时跟随细胞质成分遗传给新生的子细胞，这是 保证目的基因稳定表达的因素之一。
②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以 使目的基因在增殖的细胞中稳定表达。
③具有多克隆位点，便于目的基因的插入。
④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功 转染了该载体的靶细胞。
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的
稳定表达
实验材料
HO8910：人卵巢癌细胞系 转染质粒：pEGFP-N1载体，带有荧光蛋白基因的空质粒。 脂质体：HilyMax阳离子脂质体，可应用于转染贴壁 或悬浮细胞的瞬转及稳转，适用于含血清的培养基， 细胞毒性低，效率高且稳定，也能用于转染siRNA。 转染培养液：Opti-MEM，营养条件较好的无血清培养液，在含
外源核酸在细胞中的定位
脂质体转染细胞的优点：操作方便，安全性高。 脂质体转染细胞的原理
转染对细胞的要求：
细胞生长状态决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一 般要求在转染前一日，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺 满培养器皿的60%为宜；转染当日，在转染前4小时换新鲜培养 液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换新鲜培养液。
GFP
绿色荧光蛋白的应用
在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个 报告基因(reporter gene)。
利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细 胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体 观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不 影响自身的发光功能 。