污染处理方法
• Sephadex LH20柱子被弄脏了，大 LH20柱子被弄脏了 柱子被弄脏了，
多数情况下是由于样品没滤, 多数情况下是由于样品没滤, 将柱头 堵住,或由于样品的死吸附( 堵住,或由于样品的死吸附(一般很少 发生),使柱子的柱头部分污染 使柱子的柱头部分污染。 发生),使柱子的柱头部分污染。 • 一般的处理是将被污染的柱头部分的 填料弃去,具体做法很简单, 填料弃去,具体做法很简单,只将被污 染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起, 染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起, 倒掉即可。 倒掉即可。
使用方法
• 制备凝胶悬浮液 • 装柱 • 平衡 • 上样 • 洗脱 • 再生 • 污染处理
制备凝胶悬浮液
• Sephadex LH-20在使用之前必 LH-20在使用之前必
溶胀。 须进行溶胀 须进行溶胀。 • 在室温下，将凝胶溶胀于层析溶 在室温下， 剂中至少三小时。 剂中至少三小时。 • 在溶胀的过程中，要尽量避免过 在溶胀的过程中， 分搅拌，否则会破坏球形胶粒， 分搅拌，否则会破坏球形胶粒， 且要避免使用磁力搅拌器
• 将干胶往水里加，边加边搅，以 将干胶往水里加，边加边搅，
防凝胶结块，然后放到沸水浴中 防凝胶结块， 加热接近100℃ 加热接近100℃，几个小时就可 以使其溶胀， 以使其溶胀，还可起到除去颗粒 内部气泡和杀菌作用。 内部气泡和杀菌作用。
• 使溶胀胶体积沉淀之后占总体积
的75%，上层溶剂占25%，这 75%，上层溶剂占25%， 时，悬浮液从一个容器倒入另一 容器时胶粒可移动。 容器时胶粒可移动。
洗脱液进行清洗，如更换洗脱液，则 洗脱液进行清洗，如更换洗脱液， 需要重新平衡 • 在洗脱过程中，所有组分一般都可被 在洗脱过程中， 洗脱下来，所以装好柱后， 洗脱下来，所以装好柱后，可反复使 无需特殊的再生处理。 用，无需特殊的再生处理。
• 多次使用后，凝胶颗粒可能逐渐沉积 多次使用后，
压紧，流速变慢。 压紧，流速变慢。这时只需将凝胶自 柱内倒出，重新填装。或使用反冲法， 柱内倒出，重新填装。或使用反冲法， 使凝胶松散冲起，然后自然沉降， 使凝胶松散冲起，然后自然沉降，形 成新的柱床，这样流速会有所改善。 成新的柱床，这样流速会有所改善。
交联葡聚糖凝胶的化学结 构
2 Sephadex LH-20性质 LH-20性质
• 交联度小，机械强度低，不耐压，溶胀性 交联度小，机械强度低，不耐压，
大 • 具亲脂性和亲水性，水及有机溶剂中都能 具亲脂性和亲水性， 应用 • 可用于分子筛层析、吸附层析和分配层析 可用于分子筛层析、 • 应用范围广泛，适合用有机溶剂分离嗜脂 应用范围广泛， 性分子 • 载样量高，极少需要再生 载样量高，
保存方法
• 暂时不用时可水洗-含水醇洗（醇的 暂时不用时可水洗-含水醇洗（
浓度逐步递增）-醇洗，最后泡在醇 浓度逐步递增） 醇洗， 中贮于磨口瓶中备用。如长期不用时， 中贮于磨口瓶中备用。如长期不用时， 可以在以上处理基础上，减压抽干， 可以在以上处理基础上，减压抽干， 再用少量乙醚洗净抽干， 再用少量乙醚洗净抽干，室温充分挥 散至无醚味后，60-80度干燥后保存 度干燥后保存。 散至无醚味后，60-80度干燥后保存。
• 吸附原理 • 吸附：范德华力或产生氢键 吸附： • 反相分配原理 • 分配：极性与非极性溶剂组成的混合 分配：
剂（反相溶剂）中起到反相分配的效 反相溶剂） 果
• 使用反相溶剂洗脱，极性大的化 使用反相溶剂洗脱，
合物保留弱，先被洗脱下来， 合物保留弱，先被洗脱下来，极 性小的化合物保留强，后出柱。 性小的化合物保留强，后出柱。 • 如果使用正相溶剂洗脱，这主要 如果使用正相溶剂洗脱， 靠凝胶过滤作用来分离。 靠凝胶过滤作用来分离。
• 如果柱子整个被污染,若是 如果柱子整个被污染, Sephadex LH-20用作反相被污染， LH-20用作反相被污染 用作反相被污染， 办法如下：依次用水, NaOH-NaCl水 办法如下：依次用水, NaOH-NaCl水 溶液， 甲醇洗涤被污染的柱子。 溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。
• 因为是整个柱子被污染，所以污染物 因为是整个柱子被污染 整个柱子被污染，
注意问题
• 1装柱操作压力 • 2样品浓度及上样量 • 3洗脱流速 • 4样品及溶剂处理 • 5鞣质易死吸附，黄酮分离效佳 • 6保存加乙醇时，切忌一上来就用浓
乙醇处理，以防结块
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洗脱
• 所有的缓冲液都应该离心或经过
0.45um的膜过滤以除去杂质。 0.45um的膜过滤以除去杂质。 的膜过滤以除去杂质 • 洗脱流速应根据情况而定，最大张性流 洗脱流速应根据情况而定， 速约12cm/min（反压1.5ba）， ），建议 速约12cm/min（反压1.5ba），建议 流速为1 10cm/min。 流速为1-10cm/min。流速不宜过快且 要稳定。 要稳定。 • 洗脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗 洗脱液的成分也不应改变， 粒的胀缩引起柱床体积变化或流速改变。 粒的胀缩引起柱床体积变化或流速改变。
上样
• 一般要求样品粘度小于0.01Pa·s（帕斯 一般要求样品粘度小于0.01Pa·
卡.秒），这样才不致于对分离造成明显 ），这样才不致于对分离造成明显 影响。 影响。 。 • 上样量视被分离物的结构性能的差异而 差异大，可大；差异小，应小。 定－差异大，可大；差异小，应小。 • 样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好， 样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好， 但过少的样品量会造成设备和器材的浪 降低工作效率，还会造成样品稀释。 费，降低工作效率，还会造成样品稀释。
3应用原理
凝胶层析的分子筛原理
l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分 分子大小不同混合物上柱； 洗脱开始， 子扩散进人凝胶颗粒内， 子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之 大小分子分开： 大分子行程较短 大分子行程较短， 外；3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱 出层析柱， 出层析柱，小分子尚在进行中
Sephadex LH-20 LH中药生物技术 S0620336 刘利
Байду номын сангаас
• 基本内容 1结构 2性质 • 3应用原理 • 使用方法 1一般使用过程 • 2溶剂选择 • 3再生方法 • 4污染处理方法 • 注意问题
基本内容
• 1. Sephadex LH-20结构特点 LH-20结构特点 • Sephadex LH-20是Sephadex GLH-20是 G25经羟丙基化处理后得到的产物。 25经羟丙基化处理后得到的产物。 经羟丙基化处理后得到的产物 • 葡聚糖凝胶中的葡萄糖部分与羟丙基 结合成醚键形式。 结合成醚键形式。 • 亲脂性的羟丙基是同时具备吸附性层 析和分子筛功能的独特层析介质。 析和分子筛功能的独特层析介质。
• 主要性能参数
• 分离范围（球蛋白） 100-4000 分离范围（球蛋白） 100• 颗粒大小（微米） 20-150 颗粒大小（微米） 20• 应用范围 脂肪酸， 胆固醇 ，脂肪酸，
激素，维他命，天然产物 激素，维他命， • PH稳定性 PH稳定性 2-13 • 最高流速 （厘米／小时） 500 厘米／小时）
般用3 般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过 床。 • 上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个 上样前， 柱体积直到基线变得平稳为止。 柱体积直到基线变得平稳为止。 • 如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的 溶胀性质， 溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器 的位置，如使用相同的溶剂， 的位置，如使用相同的溶剂，在以后的 层析中柱平衡可以省略。 层析中柱平衡可以省略。
一定不会完全死吸附在柱上（ 一定不会完全死吸附在柱上（如果完 全死吸附在柱上， 全死吸附在柱上，污染物一定会只在 柱头部分）， ），所以用合适的溶剂一定 柱头部分），所以用合适的溶剂一定 可以将之洗下来。 可以将之洗下来。 • NaOH-NaCl水溶液配法： 8g NaOH-NaCl水溶液配法 水溶液配法： NaOH ,30g NaCl， 1000ml水。 NaCl， 1000ml水
• 溶剂 溶胀体积 溶剂 溶胀体积 LH-20在不同溶剂中的溶胀性 LH• 20在不同溶剂中的溶胀性 ml/g干胶 ml/g干胶 ml/g
干胶 能 3.6 吡啶 3.5 水 3.5 甲醇 4.0 丙醇 1.6
• 二甲亚砜 4.2-4.4 4.24.0-4.3 4.03.8-4.2 3.83.7-4.2 3.73.4-3.8 3.4-
溶剂的选择
• 主要考虑能溶解样品、湿润凝胶、不腐 主要考虑能溶解样品、湿润凝胶、
蚀色谱仪、纯度高、毒性低、 蚀色谱仪、纯度高、毒性低、溶解性能 能溶解多种高分子、粘度尽可能低。 好，能溶解多种高分子、粘度尽可能低。 • 适用溶剂：满足上述条件，根据分离 要 适用溶剂：满足上述条件， 求选择即可， 求选择即可，如：水 DMF 丙酮 乙醇 乙 酸乙酯 甲醇 氯仿 THF 正丁醇 二氯乙烷 • 常用溶剂：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二 常用溶剂： 甲醇氯仿氯甲烷 甲醇-水 氯仿-甲醇
• 用低级醇为溶剂时，对芳香族、 用低级醇为溶剂时，对芳香族、
杂环族化合物仍有吸附作用。但 杂环族化合物仍有吸附作用。 用氯仿时则可去除对上述化合物 的吸附作用， 的吸附作用，而对含羟基与羧基 的化合物却有吸附作用。 的化合物却有吸附作用。
再生方法
• 凝胶再生通常是先用2-3个柱体积的 凝胶再生通常是先用2
• 一般是在柱内先装入约1/3高度的水 一般是在柱内先装入约1/3高度的水
或缓冲液， 或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅 拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内， 拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使 其自然沉降。如此连续操作， 其自然沉降。如此连续操作，可以得 到一个均匀的柱床。 到一个均匀的柱床。
平衡
• 新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一 新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，
乙醇 异丙醇 四氢呋喃 二氯乙烷 甲苯