装柱由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。

凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。

最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。

将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。

柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。

最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。

3、柱均匀性检查凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。

由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。

也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。

4、上样凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。

凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。

为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。

样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。

当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。

用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。

当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。

重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。

随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。

整个过程一定要仔细，避免破坏凝胶柱的床层。

.交联葡聚糖：葡聚糖凝胶颗粒的商品名，用于凝胶过滤，其大小不同颗粒可用于对各种不同原子量的物质进行分离，作分子筛色谱法介质这是葡聚糖凝胶，G后面的数字代表凝胶颗粒的大小。

具体操作详见，说明书啊！但是G-200的分离范围好像也不大啊，只有20万Sephadex G-100 对多糖的分离范围最大直到10万，而多糖大于十万的多得是呢只适用于水中应用，不同规格分离不同分子量范围的化合物。

sephadex g25 g25是什么意思？参考见解：Cross-linked dextran gel G-25,葡聚糖凝胶G-25,白色珠状颗粒。

一种由葡聚糖经醚键相互交联合成具有多孔性三度空间网状结构的高分子分离材料，为稳定的亲水性凝胶，G-10是表示G类凝胶吸水量的型号。

可将G后的数字除以10即为该凝胶每克干重所吸水分的毫升数。

能使一定分子量范围的大分子进入凝胶的网状结构内，不溶于水、盐分离和提纯蛋白质、多糖、酶、核酸、激素、氨基酸、多酞和抗菌素等。

比较基础，适合新虫学习！一、装柱装柱子（添硅胶）时，常用的有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。

不论干法还是湿法，硅胶（称为固定相更为广义）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右（长度没有绝对之说，根据自身情况而定，制备的大柱可以长达一米），太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。

湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压（土方法可以用养鱼的氧气泵加压或是用氮气，当然不加压也可以）用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。

（我一般都用湿法装柱）干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实（一般柱子不敢用油泵抽，怕把柱子抽裂了）。

接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。

通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。

干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到）（梯度洗脱时，湿法装柱也会出现该情况，比较不好处理，可以缓慢改变溶剂，且置于通风处），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚（用乙醚最最明显），二氯甲烷更为明显。

虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。

解决的办法是：第一、硅胶一定要压结实；第二、一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。

也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂(我一般垫张滤纸，撒上石英砂，再放些棉花)，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。

但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。

二、上样上样也有干法和湿法之分：干法（也称硅胶制沙）就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。

如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。

干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。

（我一般喜欢用这种方法，除非不能用）湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。

然后用少量溶剂洗涤后，再加入。

湿法较方便，但不溶剂让其完全被硅胶均匀吸附，不容易跑的很平整柱层析关键在于柱子是否装好（这是最大影响因素）和淋洗剂是否选择恰当。

而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。

这里要指出的一点是：TLC （作用还是很大的）的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。

上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。

淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。

由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。

（这一点很实用，不过有些特殊情况也不一定，如果要保险可以先做根小柱子跑一下，这样最安全，就是花点时间）三、收集主要依靠TLC（据说国外有石英柱，直接用荧光灯照能看出来，不过太贵了，在国内不一定适用），需要切记的是：第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。

因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。

展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。

第二、点不能点得太浓（在最后时应该点的浓点，这样看看有无收尽产品）,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。

第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适才能有一个交好的分离效果。

选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献（这是首选）中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。

很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。

不行可以尝试两两混合，三者混合，一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。

在利用TLC跟踪反应时，在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点A，每种难挥发的原料各点一个点B,C, D等等，然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点一个混合点X，这些点在板上的位置如图所示：A X B C D这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后的各个层份的点与B,C,等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点X的目的在于，方便观察，因为有时候，板展开后，各点的位置有些变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。

（我喜欢用小板，跑的快，很快见到结果，为了避免小板的边缘，用机器板较好）利用TLC判断物质的纯度时，如果不能完全确定，可以再结合其他检测手段，如NMR，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。

但有趣的是，由于H-NMR可鉴别的纯度也就在95%左右，有时候H NMR现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。

所以，两者要结合使用。

如果有标准品或是以前做过的，对个对照最方便。

资料上说，将已经溶胀好的凝胶倒入柱内，当沉积的胶床至2～3cm高时，打开柱下端的出口，直到胶装完为止。

然后再平衡,请问，当下端出口打开时，上端需不需要接上蒸馏水或洗脱剂？我之前没有将下端口打开，自然沉降的。

后来看到很多资料上说要将下端口打开，但是没有说明上端口是否要打开接通蒸馏水获洗脱剂。

需要接的，如果不接的话水分只出不进，胶会干的你下端打开的时候上面继续倒凝胶呀，不要间断，最重要是的不要让气泡进入一定要接水，这样形成的凝胶柱才会均匀，同时保证胶床不会暴漏在空气中我用的是C-25凝胶的，我们先用甲醇泡，酸泡，再用碱泡。

然后就装柱了凝胶在甲醇中溶胀不够，我们一般都是放置过夜的。

之前需用玻璃棒缓慢搅拌至均匀，后静置。

装住前先装装一些溶剂到柱子里，然后再将溶胀好的葡聚糖凝胶用滴管加进去，注意葡聚糖混悬液浓度不应太大，让它自然沉降，装完后再用洗耳球压实，不会出现气泡的。

有气泡必须倒出来重装！有没有人装过GE的凝胶过滤色谱柱（sephadex-G10）在固定好的层析柱中加入约1/3体积的缓冲液，关闭柱出口，在柱顶部连续加入已经充分平衡好的琼脂糖凝胶（事先把凝胶调成流动性较好的糊状物），待凝胶沉降约3cm时打开出口，并连续加入糊状的凝胶，使其在形成的胶粒床面上连续均匀的沉降，直至凝胶完全沉降至适当的柱床体积为止。

然后关闭出口，使上层有3cm高的缓冲液并在整个层析过程中一直维持，不能使柱子走空。

为了防止柱床表面不会由于溶剂或样品的加入而引起搅动，要在柱床表面加一个保护装置，如圆形滤纸片或纱网等。

调糊也应注意。

我是静置，倒出上清，加水摇起，静置倒出上清，几次后认为替换成水了。