Feulgen反应
原理介绍
自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一.Feulgen染色是经典显示去氧核糖核酸的方法,该法要求用Carnay氏液固定的新鲜组织效果最好,酒精-甲醛液次之,单纯甲醛固定欠佳,效果不满意.
自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。
其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。
Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。
也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3
DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。
1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。
孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。
碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时被氧化，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色
利用1M HCl 、60℃下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。
细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。
并广泛应用于核及染色体的研究中。
Feulgen反应步骤
标本需经固定后方可染色，Carnoy固定液可按无水乙醇：三氯甲烷：冰醋酸为6：3：1比例配制。
固定后石蜡切片即可。
尽量不用新鲜组织恒冷箱切片，因胞质中存在的缩醛磷脂会出现非特异染色。
若必须使用恒冷箱切片，需做切片后固定。
用已固定的组织石蜡切片可消除缩醛磷脂。
减少非特异染色，具体操作如下：
1．切片脱蜡入水；
2．用lmol/L HCl浸洗；
3．切片放人预热到60℃1mol/LHCi内6分钟，(固定的标本为10～15分钟．Susa固定的标本为18分钟，水解时间因固定液不同而有差异)；
4．入室温lmol/LHCl洗；
5．蒸馏水洗；
6．人Schiff液，于室温暗处(或外包黑纸)30～60分钟；
7．人亚硫酸钠水溶液漂洗3次，每次1～2分钟；
亚硫酸钠水溶液配法：
10%NaHS03 5ml
1mol/L HCl 5ml
加蒸馏水至 100ml
8．蒸馏水洗；
9．脱水、透明、封固。
结果：细胞核内DNA染成紫红色
对照实验：
虽然Feulgen法是DNA 的特异染色方法，但如果延长水解时间并在室温下进行反应， Schiff试剂也与醛、酮、醇和缩醛磷脂起反应，因此用Feulgen法检测DNA时必须严格控制盐酸水解的时间和温度。
为
减少假阳性和非特异性染色必须做对照实验。
可按上述步骤做平行对照实验，仅将第3步，即60℃
lmol/LHCl水解改为室温15分钟，其余与上述步骤相同，结果DNA应为Feulgen阴性反应。
Feulgen反应图
大鼠肾小体和肾小管细胞核呈nigert阳性反应，含紫红色反应产物
Feulgen方法应注意的问题
对照切片的制做
进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。
对照切片应不经水解直接放在schiff 剂内，且应为负反应。
但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。
固定剂的选择
以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。
后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。
实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。
如Bhampy固定剂、Helly 固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。
但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。
在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。
水解时间
Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。
如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。
或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。
适当的水解时间一般为8~12min。
但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。
Schiff试剂的作用
Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。
有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。
因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。
此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。
Giemsa染色法
MGG由May-Grunwald染料和Giemsa染料组成。
前者化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好。
因此MGG染色，可兼两者的优点，常用于细胞涂片染色。
2染液配制
I液的配制：
迈格染料 lg
甲醇 100ml
在研钵内用少量纯甲醇将染料充分研磨成均匀一致的悬液，倒人烧瓶中，加入其余的甲醇后置入37℃温箱4-6小时，每隔半小时研磨半小时，然后放入深棕色瓶内，在室温下保存，2周后使用。
临用前取上液40ml，加纯甲醇20ml混合用作工作液。
Ⅱ液的配制：
姬氏染粉 0.6g
甘油 50ml
甲醇100ml
将姬氏染粉溶于甘油内，在研钵内研磨3-4小时，使之磨匀，加入纯甲醇后搅拌均匀,放入深棕色瓶内，室温下保存，2周后即可使用。
磷酸缓冲液配制：1％磷酸氢二钠20ml，l％磷酸二氢钠30ml，加蒸馏水至1000ml，调整pH 6.4-6.8(用蒸馏水代替缓冲液，效果亦佳)。
3染色步骤
(1)自然干燥的细胞涂片(预先滴加甲醇固定更好)水平置于染色架上。
(2)将I液(用缓冲液或蒸馏水5-10倍稀释)滴盖涂片上，lO-30分钟。
(3)倒弃涂片上的I液，自来水漂洗干净。
(4)立即滴盖Ⅱ液(用缓冲液或蒸馏水5-10倍稀释)在涂片上染色10-30分钟。
(5)倒弃涂片上的Ⅱ液，自来水漂洗干净。
(6)趁湿加盖片或待干后镜检。
4染色结果
MGG染色将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色。
5MGG染色特点
染色方法简单，且兼有瑞氏、姬氏两种染色的优点，并且涂片可
保存十多年而不退色。
MGG染色对胞质胞核染色效果均较好，结构清晰，所染细胞亦比HE染色的细胞大；同时对细菌、霉菌及胆固醇结晶的显示也很清楚。
因此适用于淋巴造血系统的细胞标本、胸腹水、穿刺标本等。
尤其对鉴别恶性淋巴瘤的类型，MGG染色更有帮助。
苏木精-伊红（HE）染色
HE染色是一种以形态为基础,结合应用化学技术对组织、各种细胞进行染色的实验技术,用于研究组织细胞的生理、病理和化学结构.
碱性染料以离子键结合而被染色.苏木精在碱性溶液中称蓝色,所以细胞核被染成蓝色.伊红Y是一种化学
浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明对比.伊红是细胞浆的良好染料.
一般染色组织切片厚度为3µm左右,中枢神经系统6～8µm,肾小球基底膜染色观察时要求1.5～2µm标准厚度.
染液制备：
1.苏木精染液
(1)称取0.5g苏木精、5.0g铵矾或钾矾和0.1g碘酸钠加温溶于70ml蒸馏水中；
(2)加入30ml甘油和2ml冰乙酸充分混匀后过滤即成母液；
(3)母液可长期保存。
用蒸馏水以1：20稀释母液即成工作液。
工作液也较长时间储存，但每次染色前宜过滤，去除氧化膜；
2.伊红染液
伊红有醇溶性与水溶性之分。
将0.5g伊红溶于100ml70%乙醇或蒸馏水即成工作液；
染色步骤：
1.用37℃的温BSS漂洗3次，每次20s-1min；
2.用中性福尔马林固定30min；
3.用蒸馏水漂洗1次，再用蒸馏水稀释的苏木精液(1/20)染10min；
4.先用自来水冲洗几次，而后置入1%NaHCO3液中漂洗至蓝紫色；
5.在放入伊红水溶液中染30s-1min；
6.用蒸馏水冲洗，迅速通过丙酮2次，每次3-5min；
7.通过2：1丙酮/二甲苯3次，每次1-2min；
8.通过1：2丙酮/二甲苯3次，每次1-2min；
9.放入纯二甲苯5-10min，用光学树脂封片后观察；
10.把盖片置载物玻片上，令小盖片细胞面向上，用树胶封存，再覆以较大盖片；
结果：
原代细胞核染成红色，胞质染成蓝紫色。