20世纪80年代后期,人们开始应用微卫星序列(microsatellite,MS)绘制图谱。1994
年底，美、法完成了以RFLP及微卫星ＤＮＡ为标志的遗传图谱.图谱包含了
5826位点，覆盖4000cM，分辨率高达0.7cM．1996年法国报道了完全以微卫星
DNA标志构建的遗传连锁图，包含2335位点，分辩率为1.6cM
重复序列较高的地方难度较大。此外有许多序列片段难以定位在确
切的染色体上，成为游离片断；同时又会有许多地方由于没有足够
的覆盖率而形成空缺。这些缺陷最终导致整个基因图会留下大量的
空洞（gap），也影响其准确度
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鸟 枪 法 组 装 序 列
将DNA分子打断为小片段，测定每一段序列，通过查找每8 个 片段序列的重叠部分(需几十个碱基)，再组装得到主体序列。
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鸟枪法是小的原核生物基因组测序的标准方法
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用鸟枪法获得流感嗜血杆菌的基因组序列
鸟枪法不适用于较大的、复杂的真核生物基因组
➢ 随着片段数的增加，所需的数据分析越来越复杂。n个片 段可能的重叠数为2n2-2n；
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➢ 分析基因组的重复区域时会发生错误。
串连重复DNA的问题
基因组范围内重复的问题
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重叠群法
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遗传作图中DNA标记的发展
遗传标记的发展：
第一代标记 经典的遗传标记（蛋白质和免疫学的标记） 70年代中后期，限制酶片段长度多态性（RFLP）
第二代标记 85年，“小卫星序列"（minisatellite） 89年，“微卫星序列"（microsatellite）
第三代标记 单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphism ，SNP）
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以大片断定位的克隆为基础的定向测序战略主要采用克 隆步移法或称重叠群法：
先构建遗传图，再利用几套高度覆盖的大片段基因组文
库（BAC、PAC等）获得精细的物理图，选择合适的
BAC或PAC克隆测序，利用计算机拼装。BAC内的空洞
基本上都可以利用设计引物等手段填补，形成一条完整
的BAC序列。然后由相互关联、部分重叠的BAC克隆连
➢ 典型的形态标记用肉眼即可识别 和观察，广义的形态标记还包括 那些借助简单测试即可识别的性 状，如生理特性、抗病虫性等；
➢ 形态标记简单直观、经济方便， 容易观察记载。
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形态标记的不足
➢ 可以观察到的标记非常有限，难以建立饱和的遗传图谱； ➢ 许多形态标记受环境、生育期等因素的影响； ➢ 复等位基因位点很难全部鉴定、标记出来。
不足之处
➢ 同工酶标记都需要特殊的显色方法和技术； ➢ 某些酶的活性具有发育和组织特异性；
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➢ 标记的数量还是相对有限。
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SDS-PAGE separates proteins by MW Animation
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2.1.4 DNA标记
➢ 基于DNA水平遗传多态性构建的分子标记。
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DNA分子标记的优点
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形态标记 (morphological markers)
细胞学标记 (cytological markers)
生化标记 (biochemical markers)
分子标记 16
(molecular markers)
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2.1.1 形态标记
➢ 指能明确显示遗传多态性的外观性状， 如水稻株高，果蝇眼色等；
也俗称“霰弹法”，是随机先将整个基因组打碎成小片段进行测序， 最终利用计算机根据序列之间的重叠关系进行排序和组装，并确定 它们在基因组中的正确位置
“鸟枪法”优点是速度快，简单易行，成本较低，可以在较短的
时间内通过集中机器和人力的方法获得大量的基因片断
但是用它来测序，最终排序结果的拼接组装比较困难，尤其在部分
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➢ 同一亲本及其子代相同位点上的多态性不变；
➢ 共显性，同一凝胶电泳可显示不同多态性片段；
❖ 实验操作较繁琐，成本较高；探针必须是单拷贝或寡拷贝 的，制备较麻烦；检测中如要利用放射性同位素，易造成 环境污染；检测周期长；
❖ 检测所需样本DNA量大(5~15ug)；
❖ 可以用非放射性物质，但杂交信号相对较弱，灵敏度较同
成一个大的重叠群（Contig）。理想状况下，整条染色
体就是由一个完整的重叠群构成。
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利用重克叠隆群步移法法测序，国际上通行的标准要求BAC测序达
到十倍覆盖率，使所测的序列达到99.99％以上的准确度。的工作。
➢ 遗传多态性丰富；
➢ 共显性遗传，信息完整；
➢ 在基因组中大量存在且分布均匀；
➢ 稳定性、重现性好；
➢ 检测手段简单快捷，易于自动化，成本较低。
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DNA标记的种类
➢ 限制性片段长度多态性 (RFLP, restriction fragment length polymorphism)；
➢ 简单序列长度多态性 (SSLP, simple sequence length polymorphism)；
❖ 微卫星序列 (microsatellite)：或称简单序列重复 (simple
sequence repeat, SSR) ，简单串联重复 (simple tandem
repeat, STR)。重复单位较短，常为2, 3或4个核苷酸单位，
重复次数一般10-50次。
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小卫星DNA
简单序列长度多态性：微卫星序列
此外，费用相对于鸟枪法要稍高一些，完成整个基因组测 序周期也要长些。但是，通过这种方法得到的基因组数据 是最为准确和精细的数据，也是基因组测序的最终目标。 大基因组“完成图”目前大多都是通过这种方法获得的。 基因组“完成图”，即完全覆盖所测物种的基因组、准确 率超过99.99％的全DNA序列图。“完成图”的覆盖率接 近100％，准确率更高，达到99.99％。
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基因组作图
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染色体结构与基因
基因组计划的基本目标
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获得全基因组顺序，在此基础上再对所获得的序列进行解 读。获得基因组顺序的主要方法是进行DNA测序，然后再 将读取的顺序组装。目前的DNA测序每次反应仅能读取不 到1000bp的长度，因此基因组测序的第一步是构建基因组 图，然后将基因组区段分解逐个测序，最后进行组装。
➢ 当前测序方法的局限：<750bp 需将DNA分子打断为小 片段，测出每一段序列，再通过重叠部分拼接成长的序 列。 鸟枪法(shotgun method)。
遗传作图→ 物理作图 → 基因组测序
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以基因组图谱为指导的两种测序方法
➢ 全基因组鸟枪法 (whole-genome shotgun method)：首先进 行全基因组鸟枪法测序，再以基因组图谱的分子标记为 起点将鸟枪法DNA片段进行组装。由下而上 (bottom to up) 的测序策略；
➢ 有些物种对染色体变异的耐受性差，难以获得相应的标19记 材料。
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2.1.3 生化标记
➢ 是指以基因表达的蛋白质产物为主的一类遗传标记系统。 主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记；
➢ 与形态、细胞学标记相比，数量丰富，受环境影响小，能 更好地反映遗传多态性。应用于物种起源和进化研究、种 质鉴定分类、抗病性筛选等。
每个SSR座位 两侧一般是相 对保守的单拷
贝序列
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SSR的优点
➢ 一般检测到的是单一的复等位基因位点，提供的信息 量高；
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RFLP
➢ 由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引 起的；
➢ 最早由Bostein 于1980年提出， 是第一种用于 作图研究的分 子标记，第一 代DNA分子标 记。
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同源染色体同一区段DNA 序列的差异， 限制酶识别的碱基顺序有专一性
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RFLP标记的特征
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基因组作图的方法
➢ 遗传作图 (genetic mapping)：采用遗传学分析方法将基因 或其他DNA分子标记标定在染色体上。构建的连锁图称 为遗传连锁图谱(genetic linkage map)或遗传图谱 (genetic map)。方法包括杂交实验、家系分析。图距单位为cM；
➢ 物理作图 (physical mapping)：采用分子生物学技术直接 将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。 构建的位置图称为物理图谱 (physical map)。图距单位： bp、kb、Mb，cR(厘镭，辐射杂种作图)。
–小卫星序列：（Minisatellite DNA）
–微卫星序列：（Microsatellite DNA, MS）
➢ 单核苷酸多态性 (SNP, single nucleotide polymorphism)；
➢ RAPD（random amplified polymorphic DNA, 随机扩增多态 性DNA标记 ）标记、AFLP（amplified fragment length 24 polymorphism，扩增片段长度多态性）标记等。
➢ 克隆重叠群法 (clone contig method)：基因组被打断许多 片段，建立重叠群，对每一片段进行鸟枪法测序。一旦 一个片段的序列测定完成，便可定位在基因组图谱的正 确位置上。由上而下(up to down)的测序策略。
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什么是鸟枪法
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全基因组随机测序战略主要采用鸟枪法（shotgun）。鸟枪法，
位素标记低，且相对价格较高。
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遗传作图中的第二代DNA标记
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简单序列长度多态性 SSLPs
发现：
小卫星序列minisatellite （1985年）