人胎盘组织造血干/祖细胞的分离富集【摘要】为了探索从胎盘组织中分离富集造血干/祖细胞（HSPC）的标化流程，采用机械法加胶原酶消化法制备人胎盘组织单个细胞悬液，用羟乙基淀粉（6% HES）法从中分离出单个核细胞（MNC），再经免疫磁珠分选法分选出CD34-、CD34+CD38-、CD34+CD38+ 3个细胞亚群，用流式细胞术对各阶段分选细胞进行表型分析并计算分选细胞的富集度和回收率。
结果表明：机械法加胶原酶消化法制备的人胎盘组织单个细胞悬液中单个核细胞（MNC）数达（12.30±3.51）×108，与脐血初始样品所含的MNC数（8.86±5.38）×108 比较差异无统计学意义，而其CD34＋细胞所占百分率［（3.93±2.31）%］则明显高于脐血［（0.44±0.29）％］。
胎盘组织单个细胞悬液经6% HES分离后MNC和CD34＋细胞的回收率分别为（45.3±11.7）％和（51.1±9.8）%；MNC经免疫磁珠分选后，其CD34＋细胞的纯度和回收率分别为（73.4±14.1）％和（52.7±11.7）%。
结论：本实验所建立的"机械法加胶原酶消化法-HES分离MNC-MACS分选目标细胞"的分离纯化方法可从胎盘组织获得高丰度、高富集度、高活性的HSPC，为进一步研究胎盘HSPC提供了比较经济、效果较好的分离富集方案。
【关键词】CD34抗原；造血干细胞；胎盘；免疫磁珠细胞分选；脐血【材料和方法】造血干/祖细胞（hematopoietic stem/ progenitor cells，HSPC）存在于人骨髓、动员的外周血和脐血等组织中。
新近，有学者提出人胎盘组织中含有比脐血更为丰富的造血干细胞；人胎盘组织中CD34+ HSPC的百分率是脐血的8.8倍，并且人胎盘组织中免疫细胞成分较少，极有希望成为今后HSPC 的新来源。
从人胎盘组织分离出高活性、高丰度的HSPC是对其进行相关生物学特性等研究的前提，目前尚无有关人胎盘组织HSPC分离的优化方案可循。
本研究旨在建立从胎盘组织中分离、纯化HSPC的标化流程，为今后人胎盘组织HSPC的深入研究打下良好的基础。
主要试剂胶原酶（collagenase Ⅳ）、羟乙基淀粉（hydroxyethyl starch，HES）为Sigma公司产品。
RPMI 1640、新生牛血清（FCS）购自于Gibco公司。
荧光标记单克隆抗体CD38-FITC、CD34-PE及CD34绝对计数试剂盒为Becton Dickinson公司产品。
免疫磁珠细胞分选试剂盒购自Miltenyi Biotec公司。
胎盘与脐血的收集收集足月分娩的人胎盘，同时采集同一胎盘的肝素抗凝脐血，HBsAg(-)，共5份。
胎盘和脐血均于6小时内进入分选程序。
胎盘组织单个细胞样品的制备多点剪取胎盘全层组织约80 g，用Hank液反复漂洗，尽量除尽胎盘组织中的残留血液，将其剪碎，再用Hank液漂洗3次。
加入0.025％胶原酶消化20分钟，用不锈钢网过滤，细胞滤液260×g离心5分钟，细胞沉淀用100 ml RPMI 1640悬浮混匀。
人胎盘组织单个核细胞（MNC）的分离胎盘组织单个细胞悬液按4∶1的比例加入6%羟乙基淀粉（6% HES），混匀, 22℃下静置45分钟至红细胞完全沉降。
吸取富含单个核细胞的上层液，按1∶3的比例加入Hank 液，400×g 离心8分钟。
弃上清，沉淀物用2 ml 含15% FCS的RPMI 1640悬浮，再按1∶3的比例加入RBC 裂解液，作用5分钟。
260×g离心5分钟，细胞沉淀物用含15% FCS的RPMI 1640洗涤、悬浮，经350目尼龙膜过滤。
镜下计数MNC细胞，台盼蓝染色观察细胞活力（细胞活力应>90%）。
MNC细胞样品进行FCM分析，并作为磁式分选的起始样品。
脐血按1∶1的比例加入Hank稀释后，同上述6% HES法分选MNC。
CD34＋细胞及其亚群的免疫磁珠分选按照免疫磁珠细胞分选试剂盒推荐的分选策略，分选胎盘和脐血MNC为CD34+和CD34-细胞组分，进而再将CD34+细胞组分分选为CD34+CD38+、CD34+CD38- 2个细胞亚群。
细胞样品的流式细胞术分析调整待测样品细胞浓度到1×106/ml，于含20 μl相应荧光标记单克隆抗体（CD34-PE、CD38-FITC）的上样管内加入100 μl细胞悬液，混匀，室温避光静置20分钟。
每管加入2 ml RBC裂解液，混匀，室温静置10分钟，180×g 离心5分钟，弃上清，重新悬浮细胞。
每管加入2 ml含0.1％NaN3 的PBS,混匀，180×g离心5分钟，弃上清，再悬浮细胞；每管加入0.5 ml 1％的多聚甲醛，混匀，2-8℃避光放置，逐一上机分析。
绝对计数则将细胞样品置于含微球的TruCOUNT管，其样品制备方法按试剂盒（ProCOUNTTM Progenitor Enumeration Kit）说明进行。
采用Cell Quest软件对标记样品进行检测分析。
单个核细胞和CD34+细胞绝对计数用ProCOUNT软件采集（每管采集2×104个细胞）和分析。
MNC及CD34+细胞的回收率和富集度按下面公式计算：CD34+(MNC)细胞回收率（%）=［分离产物的总细胞数×产物的CD34+（MNC）细胞纯度/起始标本CD34+（MNC）细胞总数］×100%CD34+(MNC)细胞的富集度（%）=［分离产物中CD34+（MNC）细胞数/分离产物的总细胞数］×100%统计学分析实验数据采用统计软件SPSS for Windows 10.0进行处理。
如方差齐，采用t检验对各组样本之间进行两两比较；如方差不齐，则采用t' 检验。
【结果】胎盘组织MNC数及CD34+细胞百分率结果见附表。
单个胎盘和单份脐血所含MNC数差异无统计学意义(P>0.05)，而CD34＋细胞所占的百分率两者比较有显著性差异（P<0.001），前者为后者的8.9倍。
HES分选MNC及CD34＋细胞的回收率胎盘组织单个细胞悬液和脐血经6% HES分离后MNC 的回收率分别为（45.3±11.7）％和（52.2±12.1）％，两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。
CD34＋细胞的回收率分别为（51.1±9.8）％和（60 3±12.3）％，两者无显著性差异(P>0.05)。
免疫磁珠分选（MACS）CD34＋细胞的富集度和回收率如附图所示，胎盘和脐血MNC经MACS分选后CD34＋细胞组分的富集度分别为（73.4±14.1）％和（78.5±12.0）％，CD34＋细胞回收率分别为（52.7±11 7）％和（61.9±5.8）％。
胎盘和脐血比较，细胞纯度和回收率均无显著性差异（P>0.05）。
【讨论】胎盘HSPC的分离富集涉及系统的质量控制，其质控环节包括制备高密度、高活力的单个细胞悬液，制备高丰度、高活力的MNC及高富集度的HSPC及其亚群。
其中任何一个质控环节都影响后续实验结果的评价。
从胎盘组织中分离富集HSPC的第一个关键环节是制备高密度、高活力的单个核细胞样品，这对评价其HSPC丰度、表型特征和相关的生物学特性至关重要。
然而，目前尚无有关人胎盘单个核细胞样品制备的优化方案可循。
本研究采用机械法加酶法分离获得了高丰度的单个核细胞初始细胞样品，说明机械分离加胶原酶消化法适用胎盘单个核细胞样品的制备。
但是，本实验中所采用的机械分离法只适合小样品制备，若要在短时间内获得整个胎盘的单个核细胞样品，则需要设计制造高通量的机械细胞分离机。
从胎盘单个核细胞悬液中进一步富集高丰度的MNC是进行后续实验的第二个关键步骤。
脐血中MNC 的分离方法主要有Ficoll（密度为1.077）密度梯度离心和6% HES分离法两种［7，8］，而有关胎盘组织MNC的分离方法未见报道。
本实验采用HES分离法，用于胎盘组织悬液MNC的分离，获得了满意的效果。
我们在实验过程中，用脐血样品比较了Ficoll和HES的分离效果，前者分离MNC 的回收率为18.83-28.25%，与文献一致，但远低于HES法。
本研究结果显示，胎盘组织细胞悬液经HES分离后，其MNC、CD34＋细胞的回收率与脐血相比，均无明显差别。
此结果说明HES分离法可从胎盘单个核细胞样品获得较高丰度的MNC，并且CD34+细胞的回收率较高。
尽管HES分离后，MNC组分中仍含有少量的RBC，但可通过适量的RBC 裂解液除去，且不影响其目标细胞的活性和生物学特征。
此外，HES分离法比Ficoll分离简便、省时，也更为经济。
MACS 已成为普遍采用的细胞分选方法，特点是分选效率高，分选速度远高于流式细胞仪，且无流式细胞仪分选前的烦琐准备，其主要不足之处是所分选细胞的纯度不及流式细胞仪。
本研究采用MACS法分选胎盘MNC中的CD34+CD38-、CD34+CD38+ 2个HSPC亚群，获得了较好的分选效果，CD34＋细胞组分的富集度为（73.4±14.14）%。
另外，用350目尼龙膜过滤样品一次作为样品上柱分离的预处理，以除去可能存在的细胞团，这有利于提高样品的过柱速度和分选效果。
综上所述，本实验所建立的"机械法加胶原酶消化法－HES分离MNC－MACS分选目标细胞"的分离富集方法，可从胎盘组织获得高丰度、高富集度、高活性的HSPC，为进一步研究胎盘HSPC提供了较好的分离富集方案。
【参考文献】1 周胜利,宋剑秋,旭日. 胎盘组织及血液中含有丰富的造血干/祖细胞. 中国实验血液学杂志, 2002; 10:142-1472 陈代雄,方宁, 刘祖林等. 人胎盘造血干/祖细胞及淋巴细胞亚群表型的研究. 中华血液学杂志, 2004;25:175-178。