透析法：
适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液，此法标记抗体比较 均匀，非特异性染色也比较少。
【主要试剂与器材】 1．器材 （1）铁立架、蝴蝶夹、层析柱、洗脱瓶、搅拌器、磁棒、
紫外分光光度计 （2）烧杯、试管、滴管、吸管、洗耳球、pH试纸、黑纸 2．试剂 （1）抗体 （2）异硫氰基荧光黄（FITC） （3）葡聚糖凝胶（Sephadex G-25） （4）pH9.5，0. 5M 碳酸缓冲液 （5）pH7.0，0.005M 磷酸缓冲液
免疫标记技术的应用 标记物与抗原、抗体的连接技术； 标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理 以及相应的检测仪器的使用方法。
免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）
是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应 的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量 的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗 体结合部位，检测出抗原或抗体。
荧光免疫标记技术
免疫标记（immunolabelling technic）
是指用一些易测定的、具有高度敏感性的标记物质：荧光素、放射 性核素、酶、胶体金、生物素、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为 追踪物，标记特异性的抗原、抗体分子进行的抗原、抗体反应。
通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原、抗体的性 质与含量。并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微 镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化 测定。
免疫荧光技术- 基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微 示踪的精确性相结合。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不 影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试 剂，用于检测和鉴定未知的抗原。
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体 复合物及其存在部位。
异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）
外观：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。 分子式：C21H11NO5S 分子量为 389.4 纯度：≥95% (HPLC) 最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长520-530nm，呈现明亮的黄绿 色荧光， 有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等
其反应式如下：
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC-NS-C-N-H2-蛋白质
FITC标记方法： 搅拌法：
适用于标记体积较大、蛋白质含量较高的抗体溶液。优点是标记时 间短、荧光试剂用量少，但此法所受影响因素较多，若操作不当会 引起较强的非特异性荧光染色出现。 直接标记法 间接标记法 改良法
绿色荧光出现在洗脱液时，用第二支试管收集全部黄绿色荧光溶液，待黄色荧光溶 液在流出层析柱口时，换用第三支试管收集，直至流出液黄色消失，则停止收集。
【结果判断】
▪ 记录收集管的OD495读数与OD280读数，
根据公式： 2.87×OD495
F / P = —————————— OD280－0.35×OD495
直方图分析：对细胞的某一个 单参数进行统计分析 横坐标为荧光或散射光强度 纵坐标为细胞数
荧光显微镜台式机---FACSCalibur
双激光--488nm
635nm 四荧光参 数 分选、浓 缩系统
大型机---FACSVantage SE
多激光多
波长八荧光 参数高速分 选单细胞点 对点分选
方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。
主要优点：
①人眼对黄绿色较为敏感，
②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
异硫氰酸荧光素(FITC)
四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）
最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm 呈橙红色荧光 与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色 其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低
荧光
荧光寿命---荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的荧光衰 减到一定程度所用时间。
荧光淬灭---荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长 时间的照射后发生的减弱现象。
淬灭剂---苯胺、硝基苯、酚等 荧光（标记）物质的保存
用于标记的抗体：高特异性和高亲和力 作为标记的荧光素应符合以下要求： 应具有能迅速而稳定地与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结 合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。 荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。 有强的荧光效应，即使标记后也不出现非特异染色荧光色泽,与背景组织 的色泽对比鲜明。容易与自发荧光及其他荧光相区别（如双重标记时） 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。 尽可能少褪色 标记方法简单、安全无毒。 与蛋白质的结合物稳定，易于保存 有良好的水溶性，溶解后不与其它物质发生化学反应， 纯净，可用标准试剂检验。
抗体工作浓度 抗体工作浓度的确定方法类似ELISA间接法中酶标抗 体的滴定。将荧光抗体自1:4～1:256倍比稀释，对 切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、 且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。
荧光抗体的保存 应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装， －20℃冻存，这样就可放置3～4年。在4℃中一般也 可存放1～2年。
反应液中荧光试剂和免疫球蛋白的比例: 抗体蛋白含量低，标记
慢，以每毫升含20-25mg蛋白为宜。
【注意事项】
严格掌握整个反应体系中的抗体蛋白含量，可提高标记效率。 装柱及上样操作参照实验一。 最后洗脱时应注意掌握洗脱速度及每管收集量。
荧光显微镜
光源：高压汞灯、氙灯、 卤素灯
1 滤板：隔热滤板、激光 滤板（UG、BG）、吸 收滤板（OG、GG）
四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）
橘红色粉末 不溶于水，易溶于酒精和丙酮 性质稳定，可长期保存 最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm 呈橘红色荧光
荧光FITC+RB200标记
荧光素FITC标记抗体
当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r 氨基与荧光素的硫碳胺键结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗 体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结 合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，
可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上对抗原、抗体反应进 行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法对体液中的半 抗原、抗原进行定性和定量测定。
具有高度敏感性、特异性、快速性。
免疫标记技术主要分为： 免疫荧光技术： 放射免疫测定：自动化仪器价格昂贵、所用试剂半衰期 短、危及人体健康 酶免疫技术：敏感、快速、简便、应用范围广、不需特 殊设备
荧光
荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引 起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一 种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用 的有机化合物，亦称荧光色素。
发生原理：基态 激发态
产生特点：激发---即刻产生 停止激发---瞬间消失
种类：光致荧光，化学荧光，X线荧光，阴极射线荧光
免疫荧光标记技术
始创于20世纪40年代初，1942年Coons等首次报道用异氰酸 荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌 多糖抗原。当时由于异氰酸荧光素标记物的性能较差，未 能推广使用。直至1958年Riggs等合成了性能较为优良的异 硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC）。 Marshall等又对荧光抗体标记的方法进行了改进，从而使免 疫荧光技术逐渐推广应用。
【影响标记的因素】
温度: 温度低则所需标记时间长，温度高则标记时间短。在0-4 ℃时标
记体需搅拌6-12h,而在7-9 ℃时搅拌4h即可, 20-25℃1-2h，37℃3045min
pH 值: pH低时，标记较慢，pH值偏高（大于10），抗体易变性，pH
值9.0-9.5最为适宜，在弱碱性条件下FITC易溶解，同时免疫球蛋白的羧基 容易暴露，便于两者结合。
2 光路：透射光、落射光
间接免疫荧光检测自身抗核抗体
荧光免疫显微技术
Laser
FALS Sensor
前向角散射光（FSC）：反映细胞的大小
Laser
荧光免疫显微技术
FALS Sensor
90LS Sensor
侧向角散射光（SSC）：反映细胞内的颗粒多少
荧光免疫显微技术
双色直接染色细胞
荧光免疫显微技术
将称好的FITC放在试管中，并用黑纸包好，然后取相当于稀释后抗体蛋白溶液体积 1/10的pH9.5，0. 5M 碳酸缓冲液溶解FITC。
开启搅拌器，将FI于9.5，则用碳酸缓冲液调整pH至9.5，加盖搅拌1小时。
用Sephadex G-25装层析柱，用pH7.0，0.005M 磷酸缓冲液（PB）平衡洗脱。 将上述标记液上Sephadex G-25柱。 用pH7.0，0.005M PB 洗脱，流速控制为1ml/分钟。 用三支试管收集：待黄绿色荧光走至离下端2cm处时，用第一支试管开始收集；当黄
计算F/P值，并对该比值作一简单分析。
荧光抗体的鉴定
效价 抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者 较为理想。 荧光素与蛋白质的结合比率 荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算
f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越 少。一般用于固定标本的荧光抗体以f/p＝1.5为宜，用于 活细胞染色的以f/p＝2.4为宜。
【操作方法】
取已知浓度的抗体蛋白溶液，用pH9.5，0. 5M 碳酸缓冲液稀释至最终浓度为20mg/ml。 置于包黑纸的小烧杯中，并放入磁棒。
称取适量FITC：按FITC(mg)/抗体蛋白(mg)的质量比为1/100，并计算出需要FITC的 量。即：FITC的量(mg)=待标记抗体蛋白总量(mg)×0.01。