微尺度流动显示及速度测量李战华郑旭中国科学院力学研究所非线性力学国家重点实验室（LNM），北京100080摘要：本文综述了微尺度流动显示和速度测量的前沿技术：MicroPIV、Confocal、TIRFM、MTV、QD等，介绍其工作原理、主要技术指标、适用范围等。

通过对各种系统的分析说明观测微流动需要解决的主要问题，为进行微流动的实验研究和发展微流动观测技术提供参考。

关键字：微流动、流动显示、MicroPIV、Confocal、TIRFM、MTV、QD1.引言微尺度流动是指特征尺度在0.1μm ~ 1mm之间的流动，通常出现在微机电系统（MEMS），特别是微流控芯片（Microfluidic）中。

例如，DNA检测使用的毛细管电泳芯片，微分析系统(μTAS)中使用的微分离器、微阀等器件，均由微米尺度的通道组成。

微尺度流动的主要特点是：低Re数，表面力作用为主，与Capillary数、Bond数有关，工作液体多为复杂液体等。

微尺度流动特性对系统的性能有很大影响，对微流动特性的研究一直受到关注。

微流动特性研究的重要手段之一是进行流场观测。

微尺度流动显示与宏观流动显示主要不同是需要提高空间分辨度和利用高亮度探测仪器等。

宏观速度测量仪器的空间分辨率在几十微米以上：热膜流速仪的探头直径为5μm，长1.25mm，LDV的光斑直径约2mm，这些仪器无法用于微尺度流动测量。

宏观流动显示的示踪粒子直径>1μm，而微流动中的荧光示踪粒子直径在50-500nm。

按照Reyleigh散射定律粒子光强与直径的6次方成比例衰减，因此需要高光学灵敏度探测器。

为了实现微尺度流动诊断，必须对宏观流动显示方法进行改进，采用新的实验仪器或手段。

目前微流动显示方法很多，按照所使用的显微镜系统分为：倒置荧光显微镜、透射显微镜系统、共聚焦显微系统Confocal等。

按照选用的入射光种类分为：利用激光光源的Micro-PIV，利用x射线的X-PIV，利用近场隐失波的TIFMR等。

按照选用的示踪粒子分为：荧光粒子法、分子示踪法和量子点示踪法等。

本文将综述微尺度流动显示和速度测量的主要方法：MicroPIV、Confocal、TIRFM、MTV、QD等，介绍其工作原理、主要技术指标、适用范围等。

通过对系统的分析说明观测微流动的困难和需要解决的主要问题，为进行微流动的实验研究、观测微流控器件的流动特性和发展微流动观测技术提供参考。

2.微观粒子图像测速（Micro-PIV）2.1特点与发展现状（1）原理Micro-PIV是将宏观PIV测量原理应用于微尺度流动的流场测量技术，它在宏观PIV测量系统中增加了光学显微镜（图1），利用粒子的荧光提取流场信息。

（2）发展现状著名实验流体力学家Adrian研究组的Santiago（1998）[1]首次利用连续激光器、CCD和荧光显微镜组成Micro-PIV系统，测量了绕30μm柱体的Hele-Shaw流。

实验中采用的示踪粒子是直径为300nm的荧光粒子，吸收光波长532nm ，发射光波长560nm 。

实验雷诺数Re=3×10-4，流速为50μms -1。

Meinhart et al （1999）[2]利用双脉冲激光的MicroPIV 系统（图1b ），实现了30μm×300μm 矩形微管道内的速度观测，流速达到8 mms -1，速度测量的空间精度达到0.9μm 。

Stone et al （2002）[3]利用软件处理技术使MicroPIV 系统在近壁区速度测量的均方根不确定度达到60nm ，为流道内表面的非接触式测量提供了新的方法。

国内李战华研究组（2003）[4]对连续荧光下MicroPIV 的最小测量速度进行了分析，并对30×50μm 微管道低Re 数流动速度剖面进行了测量。

郝彭飞和何枫（2005）[5]利用Micro-PIV 观测了200μm 微槽道的湍流转捩和结构，发现在微管道中同样存在湍流流动模式。

王旻利和王元（2005）[6]详细综述了Micro-PIV 技术近年来的发展，并介绍了他们的实验测量结果。

(a) MicroPIV 系统示意图[2] (b) 中科院力学所MicroPIV 系统照片 图1 MicroPIV 系统示意图和照片2.2 主要技术参数(1) 空间分辨率● 光学分辨率光学仪器形成图像的清晰程度受光衍射现象限制。

根据Rayleigh 判据，光学仪器的像分辨率δ为： 0.61sin NA n λλδθ≥≈⋅ (2)其中λ为成像光波波长，NA 为物镜数值孔径，n 为介质折射率，θ镜口角。

对油镜n 为1.516，θ约140~150︒，λ为630nm ，则分辨率δ≈0.394μm 。

空间光学分辨率只与光波波长和物镜的数值孔径有关，因此X-PIV 采用x 射线（λ＝300nm ），相对于650nm 光波，空间分辨率可以提高一倍。

● 速度场测量分辨率流场图像由CCD 采集后被数字化，速度场的空间分辨率δs 可以表示为：S W LM N δ= (3)其中L 为物理平面内的观测长度、Mw 为物镜放大倍数、N 为CCD 在观测长度内的点阵数。

当使用100倍物镜时，视场80μm ，L 为8mm 。

CCD 的像素1002×1024，对应空间长度8nm 。

光斑单点化后，速度场测量分辨率可达80nm 。

(2) 工作距离工作距离为物镜到标本的距离（已扣除盖玻片的厚度约0.17mm ）。

这个参数对微流动实验很重要，因为它限制了微流道观测表面的厚度。

对于100倍的物镜，工作距离只有0.1mm 。

(3) 焦点深度和测量深度● 焦点深度显微镜光轴焦点上下可以看清物体的范围叫做焦点深度或景深（Depth of field ），由下式确定：2Z n n e NA M NA λδ=+⋅ (4)其中n 为介质折射率、NA 为镜头数值孔径、M 为显微镜总放大率、e 为图像探测器的最小分辨率。

当使用100倍物镜和10倍目镜时(M=100×10)，n=1.515，CCD 在1×1工作模式下，e 为8μm ，则焦点深度为0.522μm ，可以清楚地观察到焦点±0.261μm 范围内的物体。

● 测量深度由于MicroPIV 是体照明，Meinhart et al （2000）[7]按照测量区域内某一平面粒子灰度与焦平面粒子灰度的相关性确定沿光路的测量范围，定义了测量深度。

测量深度与焦点深度和粒子有效直径有关。

其计算公式为：23 2.16/tan Zm p p n NA d d δλθ=++ （7）在60倍物镜，NA=1.4下，测量深度约为±1.75μm 。

由于显微镜的景深和体照明特性，在目前MicroPIV 系统中实现2D 观测比较困难，采用共聚焦显微镜可以改进平面观测（见§3）。

(4) 示踪粒子● 荧光粒子宏观PIV 的示踪粒子直径>1μm ，利用粒子散射光采集速度信息。

而MicroPIV 利用的示踪粒子直径在50-500nm ，其散射光不足以被观测，因此采用荧光示踪粒子。

荧光是发射光，当入射光照到样品上，样品内分子运动状态发生变化，样品分子吸收外来光能从高能级回复到低能级释放光能形成荧光。

在理想情况下，一个分子大约能辐射出105－106个荧光光子。

高效单光子计数器可以检测到5％的荧光光子约5000个，足以探测到单个分子。

● 布朗运动根据Einstein 公式计算粒子扩散距离，Li et al (2003)[4]计算了定常流场中直径200nm 粒子可以忽略布朗运动的最小速度约为13μm/s 。

● 荧光粒子的浓度荧光粒子的浓度对背景噪音影响很大。

Meinhart et al （2000）[7]给出4种粒子浓度在4种测量距离下的信噪比。

根据作者的实验经验，使用200nm 粒子时，浓度范围为0.02~0.1%为宜。

(5) 光信号检测器由于使用荧光粒子作为示踪粒子，MicroPIV对CCD 的光学灵敏度要求高。

Lee (2005)[8]给出不同种类CCD 适用的范围(图2)。

微流动显示至少需要选择量子效率高和暗电流低增强CCD（ICCD ）和冷却CCD(Cooled CCD)。

(6) 图像处理技术王旻利和王元（2005）[6]详细综述了Micro-PIV图像处理技术，可以参考。

3. 激光共聚焦显微镜（Laser scanning Confocal Microscope ）图2 不同种类CCD 的量子效率示意图图3 共聚焦显微镜原理示意图[9]图4 共聚焦显微镜扫描系统示意图[10]3.1原理共聚焦显微镜与传统场式(wide field)显微镜相比具有控制焦深、降低背景杂光的优点。

通过空间过滤技术去除非焦平面信息获得光学切片。

从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦（图3）。

共聚焦光学系统是对样品进行点照明，同时反射光也采用点感受器受光。

只有与焦点重合的图像会被输出，因此无用的散乱光被屏蔽掉，有效地降低了背景干扰。

共聚焦显微系统可以用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像（图4）。

由于激光束的波长较短，光束很细，所以激光共焦显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。

系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。

调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像。

3.2技术指标实用共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜（dichroic mirror），将已经通过透镜的反射光折向一套微透镜和光学针孔系统，将进入物镜的光线再次聚焦，以克服普通显微镜焦点深度过大的影响。

例如Olympus荧光显微镜IX70的景深为3μm，而共聚焦显微镜的景深只有0.5μm，可以更准确地显示指定平面的图像。

Oshima et al (2005) [11]使用CSU22(Yokogawa Electric Corp.) Confocal Micro-PIV系统具有1000帧/秒的采样速度，在40×/NA=1.25物镜采用500nm荧光粒子对血管流动进行了观测。

4.全内反射荧光显微镜（Total Interior Reflect Fluency Microscope -TIRFM）4.1原理光波从光密介质射向光疏介质，入射角大于临界角时，会发生全反射现象。

这时，尽管所有的光全部被反射回光密介质，但由于波动效应，部分光的能量会穿过光密介质透入光疏介质很薄的一层表面，平行于界面传播。

这种透入光疏介质表面的波，称为隐失波（Evanescent wave）。

在低折射率介质中隐失波的典型渗透深度为100nm。

如果样品紧贴界面放置，则隐失波对样品的垂直照射深度也为100nm。