化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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3．过碘酸盐氧化法
直接偶联
标记物可用发光剂或催化剂，适用于芳香伯胺或脂肪 伯胺发光剂，标记方法稳定标记物不易脱落，但此法不 适用于无糖基的蛋白质和含有糖基但氧化后会影响免疫 学活性的蛋白质。
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4．戊二醛法
间接偶联
氨基 芳香伯胺基
2．眯唑类化合物 较常用的是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉碱 (lophine)。
3．吖啶酯类 典型代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即光泽精 (1ucigenin)。
4．苯酚类化合物 其中主要有邻苯三酚，即焦性没食子酸。 5．芳香草酸酯类 主要有双-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和 双-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。 6．(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物
熟悉电化学发光免疫分析的基本原理和标记物， 时间分辨荧光免疫分析法的基本原理及其标记物和螯 合物。
了解荧光偏振免疫分析法的基本原理和技术特点， 化学发光免疫分析的临床应用
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第一节 化学发光免疫分析技术
基本原理 反应的底物 标记方法 反应类型 相关仪器
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三、标记方法
按照标记物的应用:
化学标记 生物标记
化学标记: 用于化学发光(酶)免疫测定
➢直接用发光物质(如鲁米诺、吖啶酯类等)标记抗体或抗原
➢以催化剂(如HRP、GOD等)和／或协同因子(如ATP、 NAD等)标记抗体或抗原
反应速度
反应物的浓度
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(四)化学发光的反应类型
直接化学发光 间接化学发光
1．直接化学发光
化学反应释放的化学能激发的是反应产物分子
A + B C* + D, C* C + h
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2．间接化学发光(敏化的化学发光 )
在化学反应中，激发能传递到另一个未参加化学反 应的分子上，使该分子达到电子激发态，再由激发态 分子返回到基态时发光；或反应首先生成一种高能量 的中间体，此中间体再将能量转移给另一个未参加化 学反应的分子，使该分子达到电子激发态，再由激发 态分子跃迁回到基态时发光的过程。
1．碳二亚胺（EDC）缩合法
直接偶联
此法可用于蛋白质分子中的游离羧基或游离氨基的标 记。常用的缩合剂有l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚 胺(EDC)和二环己基碳二亚胺(DCC )
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2．重氮盐偶联法(又称重氮化法) 直接偶联
芳香伯胺
此法简易、成本低、重复性好，但不适用于脂肪伯胺 基发光剂，因其生成的重氮盐不稳定，即使在０℃也会 生成氮气。此外，ABEI等伯胺基位于侧链者也不适用此 法。
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内容概述:
第一节 化学发光免疫分析技术 第二节 电化学发光免疫分析 第三节 时间分辨荧光免疫分析法 第四节 荧光偏振免疫分析法 第五节 化学发光免疫分析的临床应用
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教学目标和要求
掌握化学发光免疫分析技术的基本原理、反应的 底物和标记方法以及反应类型。
双功能偶联剂
由于戊二醛在溶液中以单体和聚合体形式存在，后者 占多数，所以在标记反应中双方分子间构成较大的距离， 减少了在抗原抗体反应时的空间位阻；但因偶联不易定 量控制且缺乏特异性等而未得到广泛应用
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一、基本原理
化学发光，是指伴随化学反应过程所产生的发光的发 射现象。某些物质在进行化学反应时，吸收了反应过程 中所产生的化学能，使反应物分子形成电子激发态，当 电子从激发态返回到稳定的基态时，多余的能量就以光 子的形式发射出来。这一现象称为化学发光。
A + B C* + D, C* C + h
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A + B C* + D , C* + F F* + E, F* F + h
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二、反应的底物(发光剂或发光底物)
在化学发光反应中，参与能量转移并最终以发射光子的形 式释放能量的化合物
发光免疫技术中常用的化学发光底物:
１．氨基苯二酰肼类 主要有鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼，luminol)和异 鲁米诺(5-氨基苯二甲酰肼，iso lumino1)及其衍生物。
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(一)产生化学发光反应的条件和过程
化学发光与荧光的区别:
化学能 光能
化学发光反应的条件 :
➢反应必须提供足够的激发能焓变(△H)介于170～300 kj·mol-1 之间， 才能在可见光范围观察到化学发光现象
➢吸收了化学能后处于激发态的分子或原子，必须以光子形式将能量 释放出来，或者将能量转移到另一种物质的分子上并使该分子激发， 当被激发的分子回到基态时，也以光子的形式释放能量
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(二)化学发光效率
化学发光反应的发光效率(φCl)又称为化学发光总能量的产生率
φCl取决于生成激发态产物分子的化学激发效率 (φCE) 和激发态产物分子的发射效率(φEM)。
一般化学发光反应，φCl值约为10-6
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(三)强度与反应物质浓度之间的关系 化学发光反应所发出的光的强度
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按照被标记物的结构或性质 :
对小分子物质(如甾体激素、药物等)的标记
对大分子抗原、抗体的标记(如蛋白质、核酸等)以 及对某些配基和载体的标记
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按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点:
直接偶联 通过偶联反应，使标记物分子中的反应基 团直接连接在被标记分子的反应基团上。
碳二亚胺缩合法、过碘酸盐氧化法、重氮盐偶联法和混合酸酐法
间接偶联
在标记物与被标记物之间插入一条链或 一个基团，使两种物质通过这种引入的 “桥”连结成结合物
琥珀酰亚胺活化法、O-(羧甲基)羟胺法、异硫氰酸酯衍生物和戊二醛法
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常用的标记方法