华中科技大学硕士学位论文儿茶酚胺类神经递质检测方法研究姓名：刘明杰申请学位级别：硕士专业：劳动卫生与环境卫生学指导教师：朱业湘2003.5.1华中科技大掌同挤医学鹿硪士研完生平业论文儿茶酚胺类神经递质检测方法研究研究生：刘明杰导师：朱业湘华中科技大学同济医学院环境医学研究所摘要儿茶酚胺（ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ，ＣＡｓ）包括肾上腺素（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ，Ｅ）、去甲肾上腺素（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ，ＮＥ）和多巴胺（ｄｏｐａｍｉｎｅ，ＤＡ），是由肾上腺髓质和一些交感神经元嗜铬细胞分泌的一类非常重要的神经递质，也是重要的激素物质。
儿茶酚胺在人体的心血管系统、神经系统、内分泌腺、肾脏、平滑肌等组织系统的生理活动中起着广泛的调节作用，同时还影响人体的代谢。
检测血浆、尿液中的儿茶酚胺对于嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤、高血压、心衰、肾上腺髓质增生等疾病的临床诊断具有重要意义，并且有助于甲亢、甲低、充血性心衰、糖尿病、肾功能不全、低血糖症等疾病的诊断，对神经电生理等基础医学研究也具有重要意义。
目前常用的儿茶酚胺检测方法是放射酶学法、化学发光法、荧光法和高效液相色谱法，由于样品前处理复杂和检测仪器灵敏度等的限制，在本地区没有建立起快速稳定、可以满足临床诊断和基础研究需要的儿茶酚胺检测技术。
我们在综合国内外有关检测方法的基础上，通过优化设计，建立了可以满足窳诊断和基础医学研究需要的儿茶酚胺衍生荧光测定法和高效液相色谱一电化学检测法。
主要研究内容包括以下两个方面：１．衍生荧光分析法检测儿茶酚胺的研究本研究主要包括两个方面的内容，一是样品提取纯化方法研究，二是最佳衍生条件研究。
我们比较了两种样品的提取和纯化方法，活化氧化铝和阳离子交换树脂提取纯化法。
研究发现氧化铝提取纯化儿茶酚胺的回收率要高于阳离子交换树脂，稳定性也好于阳离子交换树脂，并且活化氧化铝提取纯化法省去了操作繁杂的填充层析柱以及装柱、洗柱等操作过程，操作简便，缩短了分析时间。
并从华中韩技大拳一济巨学院疆士研竞生牛业论文吸附效率、分析时间、重复性三个方面对活化氧化铝提取纯化法中几种调节ｐＨ值缓冲液的效果做了综合比较，选择ＴＲＩＳ／ＥＤＴＡ缓冲液（Ｏ．２ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ８．６）作为调节ｐＨ值缓冲液。
我们从衍生反应的ｐＨ值、衍生试剂的用量、衍生反应的时间、衍生反应终止液的选择几个方面对衍生过程进行研究，结果表明最佳的衍生操作过程是：在１．５ｍｌ样品中加入０．２ｍｌ的ｌｍｏｌ／１ＮａＯＨ，蒸馏水ｌｍｌ，０．０５ｍＪ的０．５％铁氰化钾溶液，反应２ｍｉｎ后加入０．２ｍｌ的Ｖｃ—ＮａＯＨ溶液终止反应，静置１０分钟即可用荧光分光光度计进行测定。
肾上腺素和去甲肾上腺素浓度在０．１ｎｇ／ｍｌ～ｌＯｎｇ／ｍｌ与荧光强度之间具有良好的线性关系（Ｒ＝Ｏ．９９８２，Ｅ；Ｒ＝Ｏ．９９８５，ＮＥ），检出限均为５０ｐｇ／ｍｌ，相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为５．６４％和４．７６％，平均回收率分别为９２．５±４．２３％和８９．６±４．８９％，可以很好地满足临床诊断和基础医学研究的需要。
２．高效液相色谱一电化学检测器检测儿茶酚胺的研究本研究主要包括两个方面的内容，一是最佳色谱分离条件的研究，二是最佳色谱检测条件的研究。
我们从色谱柱、流动相、流速和柱温的选择等方面对色谱分离条件进行了研究，经过大量条件试验，选择ＶＡＲＩＡＮＢＤＳ柱作为色谱柱，磷酸５０５ｍｏ］／ｌ、柠檬酸５０ｒｅｔｏｏｌ／１、辛烷磺酸钠ｌｍｍｏｌ／１、ＥＤＴＡ２０ｍｇ／Ｉ，氯化钾２ｍｍｏｌ／ｌ，用氢氧化钾调节ｐＨ值３．５，５％甲醇作为流动相，流速为ｉｍｌ／ｍｉｎ，柱温为３０＂Ｃ。
我们选择ＶＡＲＩＡＮＰｒｏｓｔａｒ３７０电化学检测器的检测电压为＋０．６５Ｖ，研究了电化学检测器对高效液相色谱系统的特殊要求以及保证检测最大稳定性的方法。
肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺以及内标物在上述色谱分离和检测条件下得到很好的分离而没有受到干扰，四者的保留时间分别为２．８５、３．４３、６．８０和４．５８分钟，线性范围均为０．０５ｒｉｇ／ｍ］～１０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＝Ｏ．９９８５，ＮＥ；Ｒ＝Ｏ．９９８９，Ｅ；Ｒ＝Ｏ．９９８２，ＤＡ），检出限均为ｌＯｐｇ／ｍｌ，相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为３．０４％、４．０８％和８．０２％，肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺的平均回收率分别为９４．８±３．２７％、９３．５－－＋３．酾％和９１．８＋４．３２％，成为满足临床诊断和基础医学研究需要、／的常规检测方法ＮＬ）关键词：儿茶酚胺衍生荧光法高效液相色谱电化学检测器华中科技夫掌属济匪掌院磺士研竞生毕业论文ＲｅｓｅａｒｃｈｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓＡｂａｓｔｒａｃｔＣａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ（ＣＡｓ），ｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙａｄｒｅｎａｌｍｅｄｕｌｌａａｎｄｓｏｍｅｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃｎｅｌ．ｔｒｅｈｒｏｍａｆｆｍｃｅｌｌ，ａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｎａｔｍａｌｍｏｌｅｃｕｌｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｃａｔｅｃｈｏｌｒｉｎｇ，ｗｈｉｃｈａｃｔａｓｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓｏｒｈｏｒｍｏｎｅｓ．ｎｌｅｍａｉｎｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓａｒｅｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ（Ｅ）、ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ（ＮＥ）ａｎｄｄｏｐａｍｉｎｅ（ＤＡ）．Ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓｉｎｐｌａｓｍａｏｒｕｒｉｎｅｓａｍｐｌｅｃａｎｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｕｓｅｆｕｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｂｏｕｔｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ，ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅａｎｄＳＯ０１１．ＭａｎｙｍｅｔｈｏｄｓｈａｖｅｂｅｅｎｐｒｏｐｏｓｅｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＣＡｓａｎｄｔｈｅｉｒｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，ｓｕｃｈａｓｒａｄｉｏｅｎｚｙｍａｔｉｃａｓｓａｙ，ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔａｓｓａｙ，ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙａｎｄｈｉ曲ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｏｒｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｂｕｔｆｏｒｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｔｈｅｓａｍｐｌｅｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｈａｓｂｅｅｎｎｏｔａｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｒａｐｉｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｃｔｅｒｒｎｉｎａｔｉｏｎｏｆｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓｉｎＯｕｒｌａｂ．Ｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋ，ｗｅｔｒｙｔＯｄｅｖｅｌｏｐａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅａｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｍａｄａｈｉｇ｝１一ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｏｒｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆｔｗｏｐａｒｔｓ：ｏｆｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ１．ＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎＴｈｅｒｅａｒｅｔｗｏｓｅｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｏｎｅｉｓｔｈｅｓｔｕｄｙｏｎｓａｍｐｌｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｃｌｅａｎ－ｕｐｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ｔｈｅｏｔｈｅｒｉｓｔｈｅｓｔｕｄｙｏｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｗｅｃｏｍｐａｒｅｄｔｗｏｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓａｍｐｌｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｃｌｅａｎ－ｕｐ，ｔｈｅａｃｔｉｖａｔｅｄａｌｕｍｉｎｉｕｍｏｘｉｄｅａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅｒｅｓｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｆｏｕｎｄａｃｔｉｖａｔｅｄａｌｕｍｉｎｉｕｒａｏｘｉｄｅｍｅｔｈｏｄＷａＳｍｏｒｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｐｒｅｃｉｓｅ．ＷｅｓｔｕｄｉｅｄｓｅｖｅｒａｌｐＨａｄｊｕｓｔｉｎｇａｇｅｎｔｓｗｉｔｈａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ、ｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｔｉｍｅａｎｄｃｈｏｏｓｅｄＴＲＩＳ／ＥＤＴＡｂｕｆｆｅｒｓｙｓｔｅｍ（Ｏ．２ｍｏｌ／１，ｐＨ８．６）．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｗａｓａｓｆｌｏｗｓ：ｔｏａｎａｌｉｑｕｏｔｏｆ１．５ｍｌｏｆｓａｍｐｌｅ，０．２ｍｌｏｆｌｍｏｌ／ｌＮａＯＨ，ｌｍｌｏｆｄｉｓｔｉｌｌｅｄ３草巾抖氩犬掌—Ｉ济馘掌窿嚷士崭竞生牛舷论文——＿——————————————————————＿———————————————＿———————————————一一一ｗａｔｅｒ，Ｏ．０５ｍｌｏｆＯ．５％Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６ｗｅｒｅａｄｄｅｄ，２ｍｉｌｌｌａｔｅｒ，０．２ｍｌＶｃ－ＮａＯＨｗａｓｗａｓｆｏｕｎｄｉｎａｄｄｅｄｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｇｍｉｘｔｕｒｅｔｏｔｅｒｍｉｎａｔｅｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ．Ａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｉｔｙｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｒａｎｇｅｏｆ０．１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌｆｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ（Ｅ）ａｎｄｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ（ＮＥ）ｆＲｊＯ．９９８２，Ｅ；Ｒ＝０．９９８５，ＮＥ）．Ｔ弧ｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｗａｓ５０ｐｅｄｍｌ－ＴｈｅＲＳＤ（％）ｗｅｒｅｌｅｓｓ５．６４％ｆｏｒＥａｎｄ４。
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