２反相色谱 一般用于分离中性或非极性化合 ． 物，Ａ５Ｈ Ｃ －Ｔ及其酸性代谢产物都是极性化合物， 因 此在反相色谱中保留时间较短， 容易受生物样本中非 保留物的干扰。 Ａ在柱前荧光衍生时的荧光衍生 但Ｃ
产物极性大为降低 ， 可以用反相 色谱分离 ６８ － 。酸性
代谢产物则可以通过调节流动相的 ｐ Ｈ改变其保留
５ ＩＡ １ －Ａ 等 。 Ｈ
２ 荧光衍 生法 为了提高检测灵 敏度 ， 可用衍 生试剂增 加儿茶酚胺 的荧光强度 ， 衍生可分柱前和柱 后衍 生两种 。柱前衍生在分离前需制备荧光衍生物 ， 操 作比较麻烦 ， 但仪器不需特 殊装置 。柱前衍生试剂
形成一个环状荧光衍生物， 检测灵敏度 Ｎ ＥＥ为
有荧光胺 Ｆ 邻苯二甲醛 Ｏ Ａ 以及 １２二苯基 Ａ Ｐ） ，
被 氧化 时还 可用研磨等方 法清洗 。碳糊 电极 在最佳
条件下其信噪比稍高于玻碳， 但其缺点是耐溶剂能力
低， 只能在低含量 甲醇 ２ ３％） ０ ０ 情况 下使用 ， 当其
电极表面被氧化后不能进行清洁， 只能将碳糊挖去，
填上新的碳糊 。参 比电极 为 Ａ ／ ｇｌ ｇＡ Ｃ， 它在检测器 的
下游， 补偿电极由不锈钢制成， 在检测器出口处。检 测器体积为５ ０ｌ －１ 。 ｉ 工作原理： ｉ ． 分析物质通过电极表面时， 当电极 所加的电位大于该物质的氧化电位（ 若是还原型， 则 电极所加的电位要比该物质的还原电位较负）则在 ，
酸钠 １ ２， 樟脑 磺酸（ ，Ｓ ２ ３ 樟脑磺酸 ９ ７ 以及 － 钠 ＣＡ ８１ －
是由徐修容等开发的用于儿茶酚胺分离的离子对试
剂， 它不仅价格便宜 ， 而且有较大的浓度选择 范围， 一
７１ ５ Ｔ －Ｃ Ａ和 － 及其代谢产物的分离 Ｈ
Ｃ Ａ是具 有氨基和酚经基 的极性化合 物 ， １ 表 为
流 出至检测池时 ， 电极表面发生下列变化 ： 在
７３ － 生物样本的贮存
儿茶酚胺极易被玻璃吸附， 曾有人用玻璃匀浆器
将脑， 电化学检测器已广泛应用于尿液、 血液、 脑脊液（Ｓ ） ＣＦ和组织样本中Ｃ 的测定， 检测极限可
达 Ｐ 水平 。 ｇ
４ 影 响 分 离 的 诸 因素
除 色谱 柱 以 外 ， 脱 液 中 洗
乙 二 胺 （ Ｐ 等 。Ｆ 能 与 伯胺 反 应 对 测 定 Ｄ ＤＥ Ａ Ａ和 Ｎ Ｅ
缓冲液 的离子浓 度 ， ， ｐ 有机改性剂 和离子对试剂 的 Ｈ 种类及 浓度 ， 等都是影 响分 离的重要 因素 ， 柱温 可以 通过变化这些因素来选择最佳 色谱 条件 ３ ２
Ｃ Ａ的微量分析 ， 能对样 品进行预处理 、 但如 富集后就 能 增 加 其 检测 灵 敏 度１， ， 然 荧 光 不 仅 能 检 测 ９４ 天 ３ Ｎ ＥＤ 还 能检测代谢 产物 Ｍ Ｐ Ｈ Ａ Ｖ Ａ及 Ｅ Ａ， ＨＧ Ｖ Ｍ
衍生试剂泵和反应器等。 柱后衍生有Ｏ 、 Ａ 三羟基吲 哚法 ２３以及甘氨酰替甘氨酸（ｙｙｌ ｉ ） ５５ ， ｇ ｃｌｙｎ 法等。 ｌ ｇ ｃｅ
Ｃ Ａ和５Ｈ －Ｔ及其主要代谢产物的名称和结构， 它们
的 分 离 可 采 用 阳 离 子 交换 色 谱 、 相 色 谱 和 反相 离子 反
对色谱 。 １阳离子交换色 谱 ． 阳离子交换 色谱是利 用儿
的功能与人们的健康和疾病有密切的关系， 它们不仅 直接参与行为活动（ 如运动功能、 学习记忆等） 以及参
离子种类 和浓度 、 冲液 的 ｐ 缓 Ｈ以及 电化学检测 器的
是 测 定 代 谢 产 物 如 神 经 母 细 胞 瘤 患者 血 清 中 的
Ｖ ＡＭ Ｐ Ｖ Ｍ Ｈ ＧＨ Ａ则贮存期可达数月。
７４ － 生物样本预处理
有些生物样本可直接 进样 ， 如笔者 曾测定 了未经 预处理 的兔脑脊液 （Ｓ 中的 Ｃ ＣＦ Ａ及其代谢 产物 ， 得 预处理步 骤如下 ： 品与氧化 铝混合 ， 样 加入 Ｔｉ ｒ ｓ
讲
座
高效液相色谱在 生物医药研究 中的应用
第七讲 生物胺的分离和测定（ — 儿茶酚胺、－ 上） ５ 羟基色胺 及其代谢产物的分离和测定
唐琴梅
（ 中国科学院上海药物研究所， ０３ ２ ０１ ０
生物胺是机体代谢反应过程中所产生的胺类化
合物 ， 其中研究得较 多的有两类 ： 神经递质儿茶 酚胺 Ｃ ） ５羟 基色胺 （－ Ｔ ， Ａ和 － ５Ｈ 以及 多胺 。Ｃ Ａ和 ５ Ｔ － Ｈ
值 ， 低 ｐ 时通 过 离 子 抑 制 作 用 延 长 其 保 留 时 在 Ｈ 间 ９１。 － 所以反相 色谱 一般适合于 Ｃ ３ Ａ的柱前荧光衍
生物及其代谢产物的测定。但也有通过梯度洗脱来 分离Ｃ 、 色氨酸及其代谢产物的报道 ４。
３反相离子 对色谱 ． 这是 目 在 Ｃ ５ Ｔ及其 前 Ａ － Ｈ 代谢产 物的分离 中应 用最广的方法 。在洗 脱液 中加 入离子 对试剂 ， 以延长 Ｃ 可 Ａ的 保留 时间， 使保 留时
近年来由于Ｈ Ｌ ＰＣ技术的不断发展， ＰＣ分 用Ｈ Ｌ
离测定体液和组织中生物胺 的方法完善 ， 检测灵敏度 可达 ｐ ｏ水平 。 ｍｌ
间较短的Ｎ ＥＥ从非保留的干扰物中分离出来， 而且 通过改变离子对试剂的浓度可以改变生物胺的保留 时间， 以此来改善生物胺及其代谢物的分离， 所以该 方法能同时分离生物样本中的生物胺及其代谢产物。 常用的离子对试剂有烷基硫酸钠 １１ ５８烷基磺 －
７２ －Ｃ Ａ的检测
１紫外检测法 紫外检测器灵 敏度较低 ， 一般不
适合生物样 品中 Ｃ Ａ的测定 ， 但可用于分泌 儿茶酚胺
Ｍ Ｔ及Ｄ Ｐ Ｃ等反应。Ｎｈ 等用ＤＥ柱前衍生测 ＯＡ ｏｔ ａ Ｐ
定了血浆 和尿液 中的 Ｎ ＥＥ Ｄ Ａ及 Ｄ Ｐ Ｃ 检测灵 敏 ＯＡ ， 度可达 ２ ｏ ６ ｆ ｌ， ｍ ７ 柱后衍生将分离、 衍生物制备和检测 自动连续地 进行 ， 检测灵敏度可达几十个 Ｐ ， ｇ但在仪 器上需引入
绍。
决， 一般Ｅ Ｔ Ｄ Ａ的浓度为 ０１ ｍ ｌ 。 ．ｍ ／ ｏＬ
ｉ ．电化学检测器的结构： 以目前市场上使用较 多的美国Ｂ Ｓ公司的电流检测器为例， Ａ 电化学检测 器由薄层检测器和电路控制两部分组成， 薄层检测池
由工作 电极 、 比电极和补偿 电 组成 。 作电极位 参 极 工
于薄层检测器的中央， 电极材料常用的是玻璃碳或碳 糊。 玻璃碳是最好的电极材料， 它的优点是可耐受Ｌ Ｃ 的任何溶剂， 适用电位很宽， 可正、 可负， 当电极表面
与血压 、 、 心率 呼吸和睡眠等植物神经功能的调控 ， 还
与一些功能性疾病如精神分裂症、 忧郁症以及器质性
病 变 （ 巴金森 氏综合症 、 如 心血管性疾病等） 的出现有
茶酚胺的氨基进行离子交换， 因此它主要用于儿茶酚 胺的分离， 也可用于分离带氨基的代谢产物 １ Ａ － ５Ｃ 的酸性代谢产物在阳离子交换柱上没有保留， 因此它
＊ 其结构式参见有关生 物化学方面的 教科 书。
般 的烷 基磺酸钠如 庚烷 磺酸钠在 洗脱液 中的浓度增 至 ５ ｍｌ ｍ ／ ｏ Ｌ时， 儿茶酚胺的 ｋ及分 离效果 不再增加 （ ７１， 图 － 而樟 脑磺酸 的浓 度达 到 １ｍ ｌ ３ ｍ ／ ｏ Ｌ时 Ｃ Ａ
的 ｋ 仍有上升趋势（ ７２ ， 图 － 因此在浓度选择上的烷 基磺酸钠有更大的灵 活性 。
０ ｎ Ｄ 为０ ｎ３７ ．ｇ Ａ ．ｇ ３ ２ ６ ６。
３电化学检测法 ． １电化学检测器及其工作原理 电化学检测器
具有高灵敏度和高选择性 ， 凡具有 电化学活性的化合
工作 电压都对生物胺的 电化学响应有较大 的影 响（ 图
８４５。此外在缓冲液中添加Ｅ Ｔ －， Ｄ Ａ是必不可少的， ＥＴ Ｄ Ａ可从络合洗脱液途经金属管道时溶解少量金
不能同时分 离酸性和 中性代谢产物 。
关， 某些肿瘤如神经母细胞瘤及嗜铬细胞也会导致 Ｃ 的异常代谢。多胺则与细胞增殖有关， 并发现肿
瘤病人尿液中的多胺含量增加 ， 生物胺及其代谢 因此
产物的测定对疾病的诊断、 治疗以及药物研究都有重
要意义 。 表 ７１ － 儿茶酚胺、 Ｈ 及其主要代谢产物的名称及 ５Ｔ － 缩写名
到满意的结果 ２（ － 在测定尿液中Ｈ Ａ５Ｈ－ ９ 图７ ６。 Ｖ －Ｉ Ａ Ａ和Ｖ ＭＡ时也有直接进样的例子３１。 ３６ 但直接进
样会减 少柱寿命 ， 在测 定复杂成分时会有 干扰峰 ， 因 此特别是对尿和血 液样本进行 预处理是必 要的 。样
本预处理可采用一步法， 也可采用二步或多步法。
１沉液蛋 白法 ． 常用于组织样本及 Ｃ Ｆ Ｓ 样本 。
ｂｆｒ调节ｐ ８０激烈振摇， Ａ吸附到氧化铝 ｕｅ， ｆ Ｈ ． 使Ｃ 上， 离心， 氧化铝用重蒸水洗数次， 以除去杂质，Ａ可 Ｃ 以用酸洗脱。 ４阳离子交换树脂预处理 利用Ｃ Ａ在ｐ ６５ Ｈ． 时可以被阳离子树脂保留， 并可被硼酸洗脱的特性进
行样 品预处理 ， 子树脂不能保 留酸性 代谢产物 、 阳离
１脑组织 大鼠或小鼠快速断头取出全脑， 在 干冰上迅速分离所需部位， 固化后称重， 置于塑料管
中于 －６ ℃冰箱保 存直至测定 。检 测时在 脑组织 中 ０
醇代谢产物及氨基酸等， 故适合于复杂样品的预处 理２。 ３ 如果离子交换后再用氧化铝吸附法浓缩， 可进
一步提高检测灵敏度 １ ９
加入 ０５ １０ ｌ ５ｏ Ｌ冰冷的过氯酸， ． ．ｍ ００ｍ ｌ ． ／ 在冰冷 却下以内切式组织匀浆器匀浆 １ｉ， ｍｎ然后于４ ℃以下
是很灵敏 的方法 ， 但它不能与仲胺如 Ｅ反应。 Ｐ Ｏ Ａ在 还原 剂如 ２巯基 乙醇等的存在 下与伯胺 生成 比荧 光 － 胺更强 的荧光衍 生物 ８ 但 它有 Ｆ ， Ａ同 样的缺 点， 不 能用于 Ｅ的测定。 Ｐ Ｄ Ｅ是一个灵敏 的、 有选择性 的荧 光 衍生试 剂 ， 它不仅 能与 Ｎ Ｅ及 Ｄ Ｅ Ａ反 应 ， 能 与 还 它 们的代谢 产物 ３ ４二羟基 苯 乙二 醇 Ｄ Ｐ Ｇ ３ ， ＯＥ －