CIK细胞培养程序1. 将分离机采集细胞缓慢加在细胞分离液（1.077 g/ml）上，体积比为1:1，800⨯g，室温离心20分钟；2. 收集界面的白色絮状细胞加入30ml的低糖DMEM培养基，轻轻吹打混匀，300⨯g，室温离心10分钟；3. 重复离心洗涤共3遍；4. 收取细胞轻轻吹打混匀，加入无血清培养基及IFN-γ500 U/ml置37℃、5% CO2孵箱中培养；5. 24 h后加入IL-2 300 U/ml，CD3 10 ng/ml，IL-1 100 U/ml 继续培养，；6. 每天观察细胞生长状态并根据情况进行换液及加入IL-2 300 U/ml进行扩增；7. 细胞收集：第14-20天收集细胞，离心弃上清液，用生理盐水洗涤细胞2 次以上，重新混匀，悬于100～200 ml 输注用生理盐水中。
附件30-32治疗方案制定从理论上来说，几乎每一位肿瘤病人都可以从免疫治疗中获得益处。
早期肿瘤病人由于机体免疫系统尚未受到肿瘤的严重影响，对免疫治疗的应答较好，疗效相对也会更好。
CIK 细胞对多种实体肿瘤均有明显疗效，对白血病也有很好作用，尤其是骨髓移植或化疗缓解后能够清除残存的肿瘤细胞，防止复发。
CIK 细胞治疗肿瘤的疗效除与输注细胞数量及活性有明显关系外，还与患者的选择有很大关系。
适应证CIK 细胞可用于下述肿瘤患者的辅助治疗：1）手术后患者，可防止肿瘤转移、复发；2）无法进行手术、放疗、化疗的中晚期患者；3）放疗、化疗失败的患者；4）放疗、化疗后、间期患者的综合治疗；5）常规药物治疗无效的癌性胸、腹腔积液患者；6）骨髓移植后或化疗缓解后的白血病患者；病例选择⑴患者预期生存>3 个月，生存质量评分（KPS）> 60%。
⑵重要生命器官功能正常，血胆红素< 68 μmol/L，天冬氨酸氨基转移酶< 90 IU/L，肌酐< 353 μmol/L，白细胞计数> 3.5×109/L，血小板计数> 80×109/L，红细胞压积>0.20。
禁忌证1) 不符合纳入标准；2) 合并心、肺、肝、肾等重要脏器的功能障碍；3) 自身免疫性疾病的病人；4) 凝血功能障碍如血友病，或凝血酶原活动度(PTA) < 50%，血小板（PLT）<40×109/L；5) 正在使用免疫抑制药物，或器官移植后长期使用免疫抑制剂的患者；免疫功能缺陷患者；6)重创伤、手术、出血、自发性细菌性腹膜炎、急性感染发作期及伴有休克的患者；7) 妊娠和哺乳期妇女；8) 高度过敏体质或者有严重过敏史者；9) 患有精神疾病者、酗酒、有药瘾或有其它不宜进行临床试验者。
中断治疗在治疗期间出现明显的毒副作用；重要生命器官出现明显功能异常；患者因某种原因提出终止治疗。
治疗途径根据治疗途径可分为全身治疗和局部治疗。
全身治疗是通过静脉输注进行；局部治疗是将收获的浓缩CIK 细胞直接注入病灶部位（胸、腹腔积液患者直接注入胸、腹腔内），也可通过介入方法。
治疗过程1、首先用成份血分离机采集病人外周血单个核细胞，大约50～100毫升；或第1～3 天连续给患者注射IL-2，每天50 万U，第4 天采集患者自体外周血50～100 ml；2、而后将采集到的细胞在超洁净实验室进行分离、诱导、扩增、激活等培养过程及质检；3、于培养的第15天左右收获并配制成回输液，间隔2-7天分5-8次回输细胞；4、观察治疗反应及疗效；间隔3～4个月可进行下一疗程的治疗。
输注CIK 细胞数量研究表明，当输注的CIK 细胞数达到一定数量时就可出现明显的治疗效果，其效果并不随着输注细胞增加而呈线性增大。
要求：每次输注的细胞数应> 1×109，每疗程输注细胞数应> 8×109。
输注的细胞中可视情况加入IL-2 100 万U。
细胞培养相关表格细胞回输变更计划细胞室：姓名由于更改治疗计划如下：改至主治医师签字：日期：回输细胞报告单细胞状况报告单病案号：细胞培养记录表检测报告单细菌检测报告姓名性别年龄住院号标本细胞培养液（注：本次结果仅对本次标本有效）检验医师：检验日期：CIK细胞免疫治疗报告书治疗过程：CIK培养情况：CIK光镜照片CIK流式细胞仪检测结果图培养人签名：自体免疫细胞制剂制备质控标准CIK细胞制备后数量、活性检定取离心洗涤后的细胞计数，（1）采用瑞氏－姬姆萨染色计数单个核细胞比例（应不低于90%）；（2）采用台盼蓝染色计数活细胞比例（应不低于97%）。
CIK细胞制备后检定报告单实验人：复核人：实验日期：检测报告单细菌检测报告姓名性别年龄住院号标本细胞培养液（注：本次结果仅对本次标本有效）检验医师：检验日期：用瑞氏－姬姆萨染色标准操作规程：1. 细胞涂片；2. 先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖；3. 稍等片刻再加姬姆萨染液2-3滴加减(根据涂片上细胞多少及增升程度酌情而定)；4. 稍等1-2分钟后,再加磷酸盐缓冲液,加时应缓慢地一滴一滴加在涂片膜上,直至膜面上染色液形成表面张力而终止染色液加入；5. 染色30-40分钟；6. 分色：用自来水缓缓冲洗至少3分钟以上，待干，勿用滤纸吸干；7. 显微镜观察计数。
用台盼蓝染色标准操作规程：1. 取细胞悬液10μl，用培养基将其稀释到2000~5000个/毫升；2. 取100μl 稀释后的细胞悬液，加入100μl 4%台盼兰溶液，轻轻混匀；3. 5分钟后用血球计数板在镜下计数细胞；4. 计算细胞活性，即未着色细胞占总细胞数的百分比；细胞鉴定标准操作规程1.形态学观察：显微镜下可见，细胞呈圆形，体积增大，胞质饱满，折光性好，有颗粒，核增大，细胞表面有很多突起和伪足。
2.表面抗原的检测：在细胞培养开始和结束(第20天)，取细胞进行实验，实验各组取细胞浓度为2 ×106/mL的细胞悬液50 uL，加入不同单抗(CD3-FITC，CD56-PE)，另设对照，室温避光孵育30 min后，PBS洗涤两次后，加入200μlPBS混匀细胞，并以1%多聚甲醛固定，4℃保存，24小时内上流式细胞仪（FACA Calibur型）用流式细胞仪检测CD3+ CD56+ CIK 细胞及CD3+CD56- 细胞比例。
每个标本分析细胞数≥1×104/L。
结果应该为：发现CD3+CD56- 及CD3+CD56+ 细胞比例明显增高，CD56阳性率不低于20％。
3.杀伤活性的检测将靶细胞K562细胞株用RPMI-1640培养基培养至对数增殖期，收集细胞用培养基液洗2次，配成4×105/mL；效应细胞(CIK)配成4×106/L或8×106/mL，将效靶细胞数按10∶1或20∶1比例混合，以1 500 r/min离心5 min，置37℃、5% CO2孵箱中孵育6 h 后，轻轻混匀，再以1 500 r/min离心10 min。
收集上清液，用全自动生化分析仪LD-P 法测定LDH的活性(U/L)。
CIK细胞的杀伤活性(%)=(测定管LDH的U-自然释放管LDH的U)/(最大释放管LDH 的U-自然释放管LDH的U)×100%当效/靶比为20:1 时，应保证CIK 细胞对自然杀伤细胞（NK）敏感肿瘤株K562 细胞的杀伤率大于40%。
.4.病原体检测收获时应保留细胞及培养基样品，供检定细菌、霉菌、支原体等病原体用，检测结果应为阴性。
制备培养过程中使用的试剂选择（一）培养基1．培养基选用RPMI 1640培养基（PromoCell GmbH公司，货号C-76025）；Cell-GRO® SCGM细胞培养基（德国Cellgenix公司，货号CE-2008）；附培养基成分2．谷氨酰胺L-Glutamine（奥地利PAA公司，货号M11-004）；3．细胞因子选用重组人白介素-1α (IL-1α)（PromoCell GmbH公司, 货号C-61112，比活性1 x 109 U/mg）；重组人干扰素γ (rh IFNγ)（PromoCell GmbH公司, 货号C-60724，比活性2 x 107 U/mg）。
重组人白介素-2 (rhIL-2)（江苏金丝利药业有限公司，国药准字S1*******）（二）冻存液成分1.二甲基亚砜（DMSO）：为保护剂(Sigma产品, 批号116K0127，货号D5879)，体积占冻存液10%。
2.人血白蛋白：华兰生物工程股份有限公司，国药准字S1*******，批号P2*******，20%人血白蛋白体积占冻存液90%。
（三）其它1.人淋巴细胞分离液1.077g/ml（天津市灏洋生物制品有限责任公司，货号LTS1077）；2.抗人CD3抗体（PromoCell GmbH公司, 货号PK-AB913-144）3.CD3-FITC（PromoCell GmbH公司, 货号PK-AB913-137）、CD56-PE（EuroBioSciences公司，货号H12196P）流式细胞荧光标记抗体及同型对照抗体（BD公司）4.乳酸脱氢酶试剂盒(购自日本世诺临床诊断制品株式会社)制备培养过程中使用的耗材品名生产商批号货号/型号备注15ml离心管Greiner Bio-OneGmbH 07260115 188261 无热原50ml离心管Greiner Bio-OneGmbH 07160115 227270 无热原650ml培养瓶Greiner Bio-OneGmbH 06410150 661160 无热原10ml 吸管Greiner Bio-OneGmbH 07092401 768180 无热原50ml 吸管Greiner Bio-OneGmbH 07092401 768180 无热原无菌滤器中国医学科学院生物工程研究所R4DN20061 PVDF2005 无热原冻存管Cryovial Simport 709986532 T309-2A 无热原CIK细胞治疗收费标准。