• 以水稻中的LAZY1基因为例：
研究现状
（Miao, J. et al ., 2013）
（Miao, J. et al ., 2013）
（Feng, Z. et al ., 2013)
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研究现状
• 2013年4月12日发表在《cell stem cell》上的一篇文章， 作者利用TALENs 和CRISPRs对人类细胞的同一基因进行修 饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。
• 不久, Carroll 与Chandra合作, 在爪蟾( Xenopus laevis ) 卵母细胞开展了ZFN 介导的外源DNA修复实验, 并取得了成功(Bibikova等2001)。
• 2002年, Carroll 又用ZFN 敲除了果蝇( Drosophila melanogaster)的一个内源基因(Bibikova等2002)。
基因组编辑技术
Gene editing tools
• ZFN • TALEN • Case9 RNA-guided
endonuclease
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• Nature杂志介绍了2014年值得关注的技术,包括 CRISPR和基因组编辑
• 2011 Nature年度技术：人工核酸酶介导的基因组 编辑（genome editing with engineered nucleases）技术
(Sanjana et al., 2012)
How does it work?
切割原理
活性
(Sanjana et al., 2012)
以二聚体发挥切割
修复原理
ü 当体内无模板时，诱发DNA损伤 修复机制。细胞可以通过 NHEJ（Non-homologous End Joining）修复DNA， 在此修过 程中删除或插入了一定数目的 碱基，造成移码，形成目标基 因敲除突变体。
• 2013年9月3日在《Cell Research》上由北京大学生命科学 学院的瞿礼嘉教授研究团队利用最新的CRISPR-Cas系统 成功地实现了对水稻特定基因的定点突变，效率达到80% 以上。
CRISPRs VS TALENs
ü 在实际应用上，CRISPRs比TALENs更容易操作。因 为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPRs 的gRNA只需要替换20个核苷酸就行，Cas蛋白不具 特异性。
(Jinek, M. et al ., 2012)
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The type II RNA-mediated CRISPR/Cas immune pathway
• gRNA
CRISPR RNA (crRNA) trans-activating crRNA (tracrRNA)
HNH亚基，切割互补链
• 2013 年 8 月8日在《Nature Biotechnology》上发表的一 文中，作者利用CRISPR- Cas系统定点突变了水稻和小麦 的OsPDS和TaMLO等5个基因。结果表明，水稻转基因植 物中突变效率为4-9.4%，这项研究首次证实了CRISPRCas系统能用于植物的基因组编辑。
• 在临床治疗上，人们不能预期引入的ZFN蛋白是不是会引起免疫系统 的进攻。
• 锌指核酸酶技术从一开始就被Sangamo生物公司所垄断，该公司只与 部分科研机构合作，它与大规模的临床应用甚至是实验室研究尚有很 大距离。
转录激活子样效应因子
(Transcription Activator-like Effectors)
• 测序
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TALENs VS ZFNs
• 锌指模块识别三联体碱基，而TALE结构域识别单个 碱基。
• 三个锌指模块串联意味着在识别序列如何识别上存 在更少的灵活性，尽管有上百个锌指模块存在，仍 然不能代表每个可能的序列。
• 锌指模块需要大量优化才实现特异性基因打靶，然 而TALE似乎即设计即使用就可以非常好地发挥作用。
基因组编辑技术：又称为基因组定点修饰技术，原则
上能在任何物种基因组的任何位置上进行定点切除，从而能 在内源性序列上产生突变。
锌指核酸酶 （ZFN）
归巢核酸内切酶（engineered meganucleases）
人工核酸酶 转录激活因子样效应物核酸酶
（transcription activator-like effector ucleases，TALENs）
• 转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)：TALEs首 先是在植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)上发现 的，特异性地结合DNA，在该病原菌感染过程中对 植物基因进行调控。一个TALE上用于序列特异性 识别的DNA结合结构域融合到一个在DNA序列产生 双链断裂(double strand break, DSB)的内切核 酸酶(FokI)的催化性结构域，便产生了TALEN。
• 这两个实验标志着用ZFN 定点修饰真核生物基因组的开端
ZFN工作原理
(Miller, J.C. et al ., 2007) R.et al., 2011)
(Gabriel，
ZFN技术的临床运用
• 传统的基因治疗的方式主要有两种，一种是利用病毒携 带完整的基因序列送入人体内或者是注入一小段正确的 DNA序列来修正错误然，而到安全性无法保证。
ü 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs 更简单方便。
• sgRNA是在crRNA：tracrRNA 基础上改造来的，二者功能 相同
(Jinek, M. et al ., 2012)
CRISPR-cas的作用位点
（Jinek, M. et al .,2012)
orange：crRNA和tracrRNA 形成发卡结构区域 yellow： protospacer DNA gray：The PAM sequence blue arrows：互补链的断裂位点 red arrow：非互补链的断裂位点
• 发展基因治疗上最基本的原则是同源重组。包括两个步 骤：首先在DNA中引入一个双链断裂，启动细胞自身的修 复系统；之后“同源重组”参考引入的相似序列作为模 板修复这段基因，从而实现指定部位的碱基替换。
• 2005年，Urnov等针对一个IL2R基因上的突变而引起严重 的免疫不全症，针对此疾病设计了四指的ZFN，利用该系 统介导了人类细胞IL2R的高效修复。在无选择压力下修 复效率达15%~18%，这样的修复效率已足够用于基因治疗。
• 该酶的催化活性必须要在DNA序列上 形成相互靠近的二聚体后才能发挥 内切酶的作用，因此，构建的人工 核糖核酸酶大多是由一对分别识别 把位点两侧DNA序列的蛋白组成。
5'-GGATG-3' 3'-CCTAC-5'
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ZFN的发现
• 最早的ZFN 出现在17年前。Johns Hopkins大学的Chandra 把锌指(zinc finger, ZF) 结构域与IIs型限制性核酸内切 酶FokI的切割域融合, 获得了具有新识别特性的核酸内切 酶(Kim等1996)。
• 单链RNA介导的CRISPR-Cas9
FokI
• 是一种存在于细菌Flavobacterium Okeanokoites 的typeIIs 限制酶， 分子量为65.4KDA，含584个氨基酸， 包含有位于N端的DNA结合区域，以 及一个位于C端的非专一性DNA切割 区块。当此酶与DNA识别域结合后， 会把位于结合位置下游的9-13个核 苷酸切除（不需特定序列）。
单链RNA介导的CRISPR-Cas9
• 锌指核酸酶（ZFN）：zinc finger nuclease，又 名锌指蛋白核酸酶，是一种人工改造的核酸内切 酶，由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切 酶构成，其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特定 位点结合，而非特异性核酸内切酶赋予剪切功能， 两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。
TALE
Xanthomonas(黄单胞菌） 三型分泌系统
(Type Ⅲ secretion system, T3SS)
TALEN的发展
• 1989年，人们发现了TALE蛋白家族的第一个成员 AvrBs3。
• 2009年，揭示了TALE蛋白特异结合宿主基因启动 子的机制。
TALE的结构
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CRISPR-Cas system
三者共进化，形成一个完整的保守系统，且共同 决定CRISPR的亚型，间隔序列提供系统的特异性
Leader：作为启动子 Cas gene：较大的多态性家族, 编码的蛋白携带有典 型的核酸酶、解旋酶、聚合酶以及多核苷酸结合蛋白的 结构域相关的功能域。
The type II RNA-mediated CRISPR/Cas immune pathway
ü 当通过TALEN产生DSB后，若能 提供同源修复模板，细胞可通 过同源重组方式修复DNA，因此 可以对内源DNA做更精细的操 作， 如点突变（磷酸化位点）、 保守区域替换等。
突变检测
• 酶切
利用实验设计时挑选的， 位于相邻靶位点之间的特异性 内切酶位点，可进行PCR产物 酶切鉴定，以筛选发生目标基 因敲除的突变个体。
TALEN的发展
• 2011年，首次把TALE与FokI结合在一起组成TALEN， 并证实TALEN起到分子剪刀的作用。
• 2012年，清华大学施一公带领的团队通过解析 TALE蛋白的晶体结构，清晰地揭示了TALE蛋白特 异识别DNA的机理。
……
Natural structure of TALEs derived from Xanthomonas sp
ZFN技术的不足
• 寡核苷酸链的长度大约为15-16个核苷酸时可以保证识别的特异性。 一个锌指结构域只能识别3bp，而如果用锌指基序作用识别的基本单 位的话，大约需要5-6个锌指串联，操作繁琐。