实验室基本操作规范、规程为保证化验工作质量，保证人身及设备安全，规范化验操作步骤，特制定本规程。

一操作安全（一）化验室用电炉、酒精灯等热源设备，操作人员一定要注意严防火灾发生。

（二）化验室用高压灭菌设备等，操作人员一定要严格按规程操作，防止蒸汽灼伤。

（三）操作人员配制和使用强腐蚀性药品时，必须做好相应的防护，严防人身伤害的发生。

二环境和卫生（一）基本要求1 进入化验室前必须换上专用拖鞋。

2 化验室内不得有蚊蝇。

3 化验室要保持清洁、有序；各房间要定期打扫，消毒；物品要定点放置且摆放整齐。

4 活体微生物要及时处理，废弃的平板要先洗完再灭菌。

5 化验室人员要注意个人卫生，勤洗衣服，勤洗澡，勤剪指甲等。

（二）无菌室使用要求1 无菌室使用前须先关闭紫外灯管，打开风机，半小时后即可进行无菌操作。

操作前要先用75％酒精棉球消毒手部、腕部等，对放在工作台上的物品也要用棉球擦拭，然后严格按无菌要求进行操作，要尽量缩短操作时间。

2 使用完毕后，要将台面清理干净，关闭风机，再次将台面用酒精棉球擦拭干净，然后打开紫光灯离开。

3 无菌室应每周清扫一次，用来苏水对地面及门窗进行擦拭，如必要时采用甲醛薰蒸法。

三基本操作（一）器皿的洗涤与包扎1 新器皿因含有游离碱，先用1%盐酸处理一夜，再用清水洗，也可用水煮0.5-1小时后，取出再用水清洗干净。

2 常用玻璃仪器如三角瓶、培养皿、试管、漏斗、烧杯等，先用毛刷沾洗衣粉或肥皂粉刷洗，然后用自来水冲洗干净，放入70-80烘箱中烘干或自然晾干，放入清洁柜内备用。

检查器皿的内壁，若水均匀分布成一薄层而不出现水珠，说明油污已除净，即可烘干备用。

3 用来做油镜观察的玻片，可以先用滤纸先把油污轻轻地擦去，然后放入肥皂水或洗衣粉水中浸泡，然后用清水冲洗，晾干备用，用时浸泡在75%浓度洒精中。

4 移液管的使用一般先用水冲洗，再插入洗液中，浸泡数十分钟后取出，用自来水冲洗干净即可。

5 接种瓶使用时先用水冲洗，然后用洗衣粉刷洗干净，再用清水冲洗，然后晾干；接种瓶口和胶管口用棉塞塞住，然后盖以纱布、牛皮纸进行包扎，放入蒸柜中进行灭菌。

（二）高压蒸汽锅的使用方法1 往灭菌锅内加水至高水位处；2 将待灭的物品放在灭菌锅内，物品之间留有适当的间隙，以利蒸汽的畅通；3 将灭菌物品最上方盖几层报纸，拧紧上盖；4 将电源打开，加热至夹层水沸腾，盖上夹层放气阀，将干燥阀扭向消毒方向，至放气阀排大气3分钟，关闭；继续升温至0.1Mpa压力时，使压力保持恒定，并开始计时；5 30分钟后关闭电源，让锅自然降压，待压力完全降至“零“后打开上盖，取出灭菌的物品；6 灭菌锅长时间不用，要放尽锅内水，以免日久腐蚀。

（三）培养基的配制1 根据配方计算出实验中各种药品所需的量，然后分别称取；2 将药品倒入杯内，加入少量的水进行加热溶解，加热过程中要不断搅拌，待完全溶解后，补足水分到所需的体积；3 用滴管逐滴加入5％氢氧化钠溶液调节PH，边搅拌边用精密PH试纸测其PH，直到符合要求为止。

4 按实验要求将培养基进行分装，装入试管中的量不宜超过总高度的1/5，装入三角瓶的量以总体积的一半为限；在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口，以免弄湿棉塞造成污染。

5 培养基分装好以后，在试管口或瓶口加上一只棉塞，一方面阻止外界微生物进入培养基内而引起的污染，另一方面保证有良好的通气性能，使微生物能不断的从外界获得无菌空气。

6 棉塞塞好以后，在外面包上一层牛皮纸，以防止灭菌时冷水的沾湿和灭菌后的灰尘侵入，贴上标签，注明培养基的名称及配制日期。

7 一般情况下，培养基配好后应立即灭菌，如不及时灭菌，应放入冰箱内保存。

8 灭菌后，固体培养基如需制成斜面，应在未凝固前将试管口方搁置在一根长的玻棒或木条上即可。

搁置的斜面要适当。

（四）转接操作1 斜面接种（1）接种前在已灭菌的接种试管上贴上标签，注明菌名，接种日期，标签纸要贴在斜面的上方，距离试管口约2-3cm的位置，便于在接种时相核对。

（2）点燃酒精灯，左手食指、中指和无名指分别夹上菌种和斜面（斜面向上），使斜面近水平。

先用右手将棉塞旋松，再拿接种环在火焰上烧红，把有可能进入试管的其余部分也过火灭菌，用右手的无名指、小手指和手掌边先后拔出菌种管和待接试管的棉塞，让试管口缓缓过火，将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接菌种管的培养基部分，使环冷却，侍冷却后轻轻沾取少量菌苔，然后将接种环移出菌和管，在火焰旁将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管，从斜面培养基的底部向上做“z“形来回密集划线。

接好种的试管口再次过火，盖紧棉塞，将接种环烧红灭菌。

（3）将接好种的斜面放在28℃恒温箱中培养。

2 试管斜面转茄子瓶（1）先将试管和茄子瓶用75％酒精棉球消毒；（2）点燃酒精灯，以左手拿茄子瓶和试管（试管放在茄子瓶中部，试管口与茄子瓶对齐，姆指在上按住试管，其余四指托住茄子瓶），将接种环通过火焰灼烧，以右手小指和手掌边缘夹住茄子瓶，小指和无名指同时夹住试管棉塞，迅速在拔火焰旁去，然后将接种环缓缓伸入试管中，靠近试管壁或边缘琼脂冷却一下，待接种环冷却后，挑起菌苔，在火焰旁迅速伸入茄子瓶中由底向上做“z“形划线，尽量将茄子瓶斜面划满，退出接种环，将瓶口及棉塞再次过火并塞紧，最后将接种环烧红灭菌。

（3）一支试管一般接3-5个茄子瓶。

3 试管（茄子瓶）斜面转摇瓶（1）将试管（茄子瓶）用75％酒精棉球擦拭干净；（2）点燃酒精灯，一人先将接种环或金属刮棒烧红灭菌，然后用左手拿试管（茄子瓶）靠近火焰，右手拔去棉塞，置于无菌区；另外一人在火焰旁拔去装无菌水或灭菌液体培养基的三角瓶棉塞，向试管（茄子瓶）内倒入少许液体，塞上棉塞，将接种环在火焰旁伸入试管（茄子瓶）内，用水冷却一下，然后将斜面上的菌苔刮下，制成菌悬液，抽出接种环，用火焰灭菌。

在无菌区拔去待转接的三角瓶的棉塞，将菌悬液倒入三角瓶中，塞上棉塞，最后置于摇床上培养。

（3）一支试管一般转一个三角瓶，一个茄子瓶一般可以转接数个三角瓶。

4 摇瓶转摇瓶（两人操作）（1）将摇瓶用75％酒精棉球拭。

（2）点燃酒精灯，先将菌液摇瓶摇晃几下，注意不要荡湿棉塞，然后一人左手倾斜拿起摇瓶，右手在火焰旁拔去棉塞，将瓶口过一下火焰。

另一个人右手倾斜拿待转接的摇瓶，左手在火焰旁拔去棉塞，迅速将菌液倒入待转接的三角瓶中，瓶口尽量少沾菌液，瓶口和棉塞先过一下火焰，然后旋紧棉塞。

（3）根据情况，一个摇瓶转数个摇瓶。

5 摇瓶菌液倒入接种瓶（两人操作）（1）点燃酒精灯，一人左（右）手拿接种瓶，瓶身稍倾斜，另外一只手拿酒精灯，灯放在接种瓶口斜下方，将接种瓶口用火焰保护起来，拔去接种瓶棉塞，另外一个人在酒精灯火焰旁拔去摇瓶棉塞，摇瓶口过一下火焰，然后将菌液倒入接种瓶内，倒的时候尽量让接种瓶口少沾菌液。

（2）菌液倒好后，在火焰旁拿出灭菌的接种瓶瓶盖，用火焰烧一下，迅速盖在接种瓶上。

四发酵液的取样操作（一）发酵液取样瓶采用100ml三角瓶，棉，外包一层皮纸，0.1Mpa压力灭菌30min后使用。

（二）取样时按无菌操作要求，由发酵工人配合。

五检验操作（一）草炭及成品含水量的测定称取草炭成品30-40克（精确到0.01克）3份，放入到烧杯内，置105干燥箱内烘干4小时，冷却后称重，根据烘干前后重量差计算含水量，取3个样品的平均值。

计算公式：H2O%= 烘干前重量—烘干后重量———————————× 100%烘干前重量（二） PH的测定1 液体菌液用PH计或精密试纸直接测定。

2 成品及草炭需随机称取样品8克，将样品置于干净烧杯内，按1:2加入无离子水，浸泡振荡均匀。

预热PH计，用标准溶液（PH6.86）校正仪器后，测定样品悬液PH，边测边搅拌，仪器读数稳定后记录，每个样品重复三次。

或取部分溶液用滤纸过滤，直接用精密试纸进行测定。

（三）草炭细度的测定称取草炭100克，放入杯内，置105 干燥箱内烘干一小时，过孔径0.18mm标准筛，称重筛下部分的重量，其与样品的重量之比，即为筛余物的含量。

（四）革兰氏染色1 加一滴蒸镏水于载玻片上，再用接种环取少量菌苔与玻片上的水滴混合均匀，形成薄的菌膜。

2 涂片在空气中干燥，然后手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上通过几次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。

3 冷却后，将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液（加量以盖满菌膜为度），染色1－2分钟，倾去染色液，用自来水冲洗，然后滴加路哥氏碘液，染1－2分钟，水洗，再滴加95％乙醇溶液脱色20－30秒，立即水洗，以终止脱色，再滴加番红2－3分钟，水洗，最后用吸水纸轻轻吸干。

（五）血球计数板直接计数法1 在正式计数前，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的菌体，若有污渍则需作清洗。

先用95％酒精棉球轻轻擦洗计数室的计数室，再用蒸镏水冲洗计数板，并用滤纸吸干其上的水分，最后用擦镜纸擦干净，然后进行镜检，直至计数室无污渍时才可用于计数，否则仍需重复能上操作。

2 将待测菌液振荡混匀，取盖玻片安放在放在计数室上面，然后用接种环挑一环均匀的菌悬液，使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室，连续二至三次，直至充满计数室平台为止，用滤纸吸干周围的水份，静置4－5分钟。

3 将加好菌悬液的计数板置于显微镜载物台的中央，先在低倍镜下寻找计数室上的大方格，寻找时显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗，然后顺着大方格线移动计数板，使计数室位于视野中间，转至高倍镜，适当调节光亮度，使菌体和计数室线条均清晰为止，然后将计数室一角的中格移至视野中。

4 通常以计五个中格的菌数来代表计数室的含菌量，将所要计数的中格中的菌计总数，为了避免重复和遗漏，将分布在方格线上的菌一律以接触方格底线和右侧线上的菌计入格内。

菌数1ml＝50000×五个中格的总菌数×稀释倍数5 计数完毕后，计数板先用95％酒精轻轻擦洗，再用蒸镏水淋洗，然后用滤纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，放入盒内。

（六）活菌计数法1 倒平板：将所检测菌的固体培基倒入6个无菌培养皿内编号为10-5、106-每个稀释度三套。

2 稀释：取10克样品放入带玻珠的100ml无菌水中，振荡20min，静置20min，编号为10 –1。

用5ml灭菌吸管吸5ml菌悬液放入45ml无菌水中混匀振荡，编号为10-2，依次稀释到10-5和10-6。

3 分别精确吸取10-5和10-6的菌液0.1ml放入对应的平板内，用灭菌的三角涂棒进行均匀涂布，然后置28 恒温箱中倒置进行培养。

培养到期后，数平板内的单个菌落数即可计数。

六原始记录的填写原始记录是实验时所做的记录，是必需保存的重要资料。

记录要真实、清楚、详尽地记录在记录本上，注明时间、品种、仪器、操作人等多项内容，要采用法定计量单位，更正记错数据时要在其上划一条线代表消去，并在旁边写明更正数据。