·论著·热疗对人肺癌细胞凋亡的影响蒋东 李芳 葛锦峰 郑世营【摘要】 目的 探讨热疗对人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞生长与凋亡的影响。
方法 ＭＴＴ法检测热疗对人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞生长的抑制作用；流式细胞术观察热疗对人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞周期和凋亡的影响；ＲＴ－ＰＣＲ检测凋亡相关基因ｐ５３及Ｃａｓｅｐａｓｅ－３的表达。
结果 热疗对人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９两种细胞的生长均有抑制作用。
热疗可以明显改变人肺癌Ａ５４９细胞生长周期的分布，Ｇ０／Ｇ１期细胞明显减少；但对人肺癌Ｈ１２９９细胞生长周期的分布影响不大。
热疗能使Ａ５４９细胞ｐ５３蛋白的表达明显增强，但不能诱导Ｈ１２９９细胞ｐ５３蛋白的表达。
热疗能同时诱导Ａ５４９、Ｈ１２９９两种细胞Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白表达的增强，并且以Ａ５４９细胞的表达尤为明显。
结论 热疗对两种肺癌细胞的生长均有抑制作用，可以增加细胞凋亡。
ｐ５３基因可能在热疗诱导肺癌细胞凋亡和周期分布改变的过程中起主导作用。
【关键词】 热疗；肺癌细胞；ｐ５３基因；凋亡【中图分类号】 Ｒ７３４ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 ０２５３－３６８５（２０１２）１５－１７３７－０３Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ＪＩＡＮＧ Ｄｏｎｇ，ＬＩ Ｆａｎｇ，ＧＥ Ｊｉｎｆｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｕｒｇｕｒｙ，Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｏｃｈｏｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｕｚｈｏｕ２１５００６，ＣＨＩＮＡ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ａ５４９ａｎｄ Ｈ１２９９．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｎＡ５４９ａｎｄ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＭＴＴ，ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｏｆ Ａ５４９ａｎｄ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＦＡＣＳ，ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＴ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓｏｆ ｐ５３ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ａ５４９ａｎｄ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｏｆ Ａ５４９ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｃｈａｎｇｅｄ ｂｙ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｉｎ Ｇ０／Ｇ１ｐｈａｓｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｏｆ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｎｏｔ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ｉｎ Ａ５４９ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｉｎ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｎｏｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－３ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ Ａ５４９ａｎｄ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｉｎ Ａ５４９ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｈａｓｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｃｉｒｃｌｅ ａｎｄ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，ｉｎｗｈｉｃｈ ｐ５３ｇｅｎｅ ｍａｙ ｔａｋｅ ａ ｒｏｌｅ．【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ；Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ；ｐ５３ｇｅｎｅ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ａｕｇｕｓｔ ２０１２，３８（１５）：１７３７－１７３９．］ 基金项目：江苏省社会发展重大课题资助项目（ＢＳ２００５０４７）作者单位：２１５００６ 江苏省，苏州大学附属第一医院心胸外科（蒋东、葛锦峰、郑世营）；苏州大学基础医学与生命科学学院人体解剖与组织胚胎系（李芳）通讯作者：郑世营 Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｙｚｈｅｎｇ８８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ 近年来肿瘤热疗已成为继手术、化疗、放疗、生物治疗之后的对肿瘤的第五类有效治疗手段。
肺癌目前的发病率和死亡率在我国男性中较高，约６５％的肺癌患者确诊时已属晚期，失去手术机会，因而包括热疗在内的综合治疗在晚期肺癌的治疗中占有重要的地位。
本研究以我们培养的Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞为实验对象，主要观察不同温度加热处理对ｐ５３表达情况不同的两种肺癌细胞生长、细胞周期和凋亡的影响，探讨热疗促肺癌细胞凋亡的机制。
材料与方法一、材料人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞株由苏州大学分子生物实验室提供。
ＲＰＭＩ１６４０培养基（Ｇｉｂｃｏ），小牛血清（杭州四季青），逆转录试剂盒、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（立陶宛Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司），引物由南京金思特科技有限公司合成。
二、方法１．细胞培养 人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞常规在含１０％小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液中，３７．０℃、５％ＣＯ２培养箱中培养，待细胞生长汇合达８５％时，用０．２５％胰酶消化，按１∶３传代。
实验时选取对数生长期细胞。
·７３７１·江苏医药２０１２年８月第３８卷第１５期 Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ａｕｇｕｓｔ ２０１２，Ｖｏｌ ３８，Ｎｏ．１５２．加温实验 实验分为两组。
对照组：将Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞装入离心管，３７℃水浴放置１ｈ；实验组：将Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞装入离心管，分别于４０℃、４２℃、４４℃水浴中加热１ｈ。
３．ＭＴＴ法检测细胞生长 将上述处理的肺癌细胞分别制成５×１０５／ｍｌ单细胞悬液，接种于９６孔板，每孔１００μｌ。
培养４８ｈ后，加ＭＴＴ １００μｌ后继续孵育４ｈ，每孔加１００μｌ ＳＤＳ－ＨＣｌ终止反应。
于３７℃存放过夜，测Ａ５７０值。
抑制率＝（１－实验组平均Ａ值／阴性对照组平均Ａ值）×１００％。
４．流式细胞术检测细胞周期及凋亡 将上述肺癌细胞离心后，新鲜培养液打匀继续３７℃、５％ＣＯ２培养２４ｈ，收集细胞，ＰＢＳ清洗两次后７０％乙醇固定，送检测细胞周期。
收集细胞，调整待测细胞浓度为２×１０６／ｍｌ，２００μｌ细胞悬液加１ｍｌ冷ＰＢＳ，１０００ｒ／ｍｉｎ ４℃离心１０ｍｉｎ，弃上清液，重复两遍，将细胞重悬于２００μｌ标记缓冲液，加１０μｌ ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ，混匀，避光室温反应１５ｍｉｎ，再加３００μｌ标记缓冲液，立刻上机检测。
５．ＲＴ－ＰＣＲ检测ｐ５３及半胱天冬氨酸蛋白酶３（Ｃａｓｐａｓｅ－３）的表达 按Ｔｒｉｚｏｌ说明书常规提取处理后人肺癌Ａ５４９，Ｈ１２９９细胞株总ＲＮＡ，按ＲＴ－ＰＣＲ一步法试剂盒说明书操作。
Ｃａｓｐａｓｅ－３上游引物序列：５′－ＣＴＣＧＧＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＴＧ－ＴＣＧＡＴＧ－３′，下游引物序列：５′－ＧＧＴＴＡＡＣ－ＣＣＧＧＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＧＣＡ－３′；ｐ５３上游引物序列：５′－ＧＣＴＡＣＧＧＴＴＴＣＣＧＴＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴ－３′，下游引物序列：５′－ＧＡＧＴＧＡＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＴ－ＴＣＡＧＧＴ－３′。
反应条件：９４℃、５ｍｉｎ预变性，然后进行下列循环：９４℃、４５ｓ，５８℃、４５ｓ，７２℃、１ｍｉｎ，共３０个循环，最后７２℃下延伸１０ｍｉｎ。
以ＧＡＰＤＨ为内参照。
ＰＣＲ反应产物置１％琼脂糖凝胶电泳。
三、统计学处理使用ＳＰＳＳ １３．０统计软件，计量数据用均数±标准差（珚ｘ±ｓ）表示，组间均数比较采用方差分析，组间两两比较采用ｑ检验，率的比较采用卡方检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结果一、ＭＴＴ法检测加热对Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞的抑制率与３７℃时比较，Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞分别在加热至４０℃、４２℃、４４℃后，两株细胞的Ａ５７０值明显降低，抑制率明显升高（Ｐ＜０．０５）。
与４０℃、４２℃时比较，两株细胞在加热至４４℃后，Ａ５７０值明显降低，抑制率明显升高（Ｐ＜０．０５）。
加热温度越高抑制程度越强（表１）。
表１ 加热后肺癌细胞的Ａ５７０值和抑制率（珚ｘ±ｓ，ｎ＝４）温度（℃）Ａ５４９细胞Ａ５７０值抑制率（％）Ｈ１２９９细胞Ａ５７０值抑制率（％）３７℃０．４４５±０．０２４ ０ ０．４５０±０．０２３ ０４０℃０．３１６±０．０３６ａ２９．０ａ０．３７３±０．０２１ａ１７．１ａ４２℃０．２３３±０．０１８ａ４７．６ａ０．３０５±０．０１９ａ３２．３ａ４４℃０．０９６±０．０２５ａｂ ７８．４ａｂ ０．１３８±０．０１７ａｂ ６９．３ａｂ 与３７℃比较，ａＰ＜０．０５ 与４０℃、４２℃比较，ｂ Ｐ＜０．０５二、流式细胞仪检测加热对肺癌细胞周期和调亡率的影响与３７℃时比较，Ａ５４９细胞在加热至４０℃、４２℃、４４℃后，Ｇ１期细胞减少，Ｓ期细胞增多，细胞调亡率明显增加（Ｐ＜０．０５）；与４０℃、４４℃时比较，加热至４２℃时细胞调亡率最高（Ｐ＜０．０５）（表２）。
与３７℃时比较，Ｈ１２９９细胞加热至４０℃、４２℃、４４℃后，细胞周期比例变化不明显，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），但细胞调亡率明显增加（Ｐ＜０．０５）；与４０℃、４４℃时比较，在细胞加热至４２℃时，其凋亡率最高（Ｐ＜０．０５）（表３）。
表２ 加热后Ａ５４９细胞的周期及凋亡率变化（珚ｘ±ｓ，ｎ＝４）温度Ｇ０／Ｇ１（％）Ｓ（％）Ｇ２／Ｍ（％）凋亡率（％）３７℃６７．８４２±１．４６３ ２０．３９３±１．５６４ １１．７６８±２．８７３ ０．５０５±０．１０９４０℃６２．１７３±１．３２４ａ２６．８９４±０．９６７ａ１０．９３３±１．３１７ ５．８１２±１．３５６ａ４２℃５２．８７１±０．５３９ａｂ ３０．０９６±０．７８６ａｂ １７．０３２±０．２７３ａ１４．２４９±０．４９９ａｂ４４℃５４．９８３±１．２１７ａ２７．７３０±０．７６４ａ１７．２８７±０．４６３ａ１０．３１５±１．１６２ａ 与３７℃比较，ａＰ＜０．０５ 与４０℃、４４℃比较，ｂ Ｐ＜０．０５表３ 加热后Ｈ１２９９细胞的周期及凋亡率变化（珚ｘ±ｓ，ｎ＝４）温度Ｇ０／Ｇ１（％）Ｓ（％）Ｇ２／Ｍ（％）凋亡率（％）３７℃６４．１９６±１．３２４ ２４．５８４±２．３５７ １１．２２０±１．６７０ ０．５９３±０．２４７４０℃６４．７４３±０．９７９ ２５．１７６±１．６８７ １０．０８１±２．６３３ ４．９１８±１．３２６ａ４２℃６２．９８５±２．３６４ ２５．３７９±１．５５９ １１．６３６±２．０３３ １０．４５４±０．４７３ａｂ４４℃６３．６２３±１．６５７ ２５．７６４±２．０４７ １０．６１３±１．６７５ ９．２８５±０．３２１ａ 与３７℃比较，ａＰ＜０．０５ 与４０℃、４４℃比较，ｂ Ｐ＜０．０５三、ＰＴ－ＰＣＲ检测加热对肺癌细胞ｐ５３及Ｃａｓｐａｓｅ－３表达的影响Ａ５４９细胞在加热处理后，ｐ５３蛋白表达明显增强，并且以在４２℃加热时其表达最强。