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液相色谱教程
(三)
液相色谱实验操作
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源
– 打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打 开计算机，启动色谱管理软件
准备流动相
– 过滤,脱气
色谱泵排气
– 用新配制的流动相灌注泵
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Pressure vs. Temperature 5000 4500 4000 3500 3000
50% MeOH 50 % ACN 100% H2O 100% MeOH 100% ACN
psi
2500 2000 1500 1000 500 0 10.0 20.0 30.0 40.0 Degrees, C 50.0 60.0 70.0
输液量均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高
– 提高检测的性能
防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低
– 保护色谱柱
减少死体积 防止填料的氧化
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流动相脱气的方法

加热 – 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易 造成流动相组成的变化 抽真空 – 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波振荡 – 简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟 左右即可) 通惰性气体（一般用氦气） – 可保持在线连续脱气，多用于低压梯度 – 可保持连续脱气，多用于低压梯度
关于色谱系统的反压
什么是反压(back pressure)
–流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压,
又称系统反压或系统压力
–Waters习惯用的压力单位是Psi(磅/平方英吋) –其它单位有:Bar,Mpa
影响系统反压的主要因素:
–流动相的溶剂组成 –温度 –流速
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有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:
– 低温密封保存 – 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
启动液相色谱仪器的流程
用准备好的流动相平衡色谱系统 – 可在泵的控制面板上设定流速参数(15×5泵需在软件 控制下操作) – 系统大约需平衡0.5--1小时方能稳定工作
准备样品 – 用流动相溶样或重组样品
编制仪器方法,开始实验
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液相色谱对流动相的要求
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反压与流速的关系
流速对反压的影响是线性关系 流速增加，反压亦增大 下图的实验条件： –2.1×30mm Symmetry C18柱,20℃
Pressure vs. Flow Rate at 20?C 5000 4500 4000 3500 3000
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实验样品的制备
标样和样品
– 标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的参 考标准物,一般是纯度较高的纯物质 – 样品:待测物,一般是成分复杂的混合物
液相色谱对样品(包括标样)制备的要求:
– 必须能溶于流动相
如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在进样 时样品在流动相中析出,堵塞管路和色谱柱
– 样品溶液要过滤除去微粒及杂质 – 了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用
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复杂样品的预处理
样品预处理的目的
– 除去微粒 – 减少干扰杂质 – 浓缩微量的组份 – 提高检测的灵敏度及选择性 – 改善分离的效果 – 有利于保护色谱柱及仪器
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50% MeOH 50 % ACN 100% H2O 100% MeOH 100% ACN
psi
2500 2000 1500 1000 500 0 0.0 0.2 0.4 0.6 mL/min 0.8 1.0 1.2
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反压与温度的关系
温度对反压的影响是反比关系 温度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些
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在线脱气机 （in-line degasser)
流动相的保存

有机溶剂流动相:
– 室温下密封,避光保存
缓冲盐流动相:
– 当日现配现用 – 低温下密封保存,一般不超过3天 – 防止微生物生长

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样品预处理常用的方法
高速离心取上清液 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-液萃取 固相提取(Solid Phase Extract,SPE )
– Oasis和Sep-Pak固相提取小柱
其它
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去除微粒的方法
过滤
– 过滤膜/过滤装置
有机滤膜(≤0.5 µ m)/水溶性滤膜(≤0.45 µ m) 膜片可更换
– 一次性使用的膜“Cartridge‖
使用方便简单，交叉污染小 有更小内径，可用于微量样品的处理
高速离心
大于：10,000rpm
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超滤
机理
– 超滤是一种基于分子ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分离的技术
色谱泵的维护保养


流动相要过滤
常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水 冲洗柱塞杆清洗孔 关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不 互溶，要用一种中间溶剂过渡 色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯 甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中

排气后的色谱泵即可用于实验运行
– 注意∶
排气后，先设流速为 0 恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱 如需要，恢复排气时断开的控制线

根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值
若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡 (包括排气操作)
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2 星期 1 星期 1天
1 小时 新鲜配制 0
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5
10 分
15
20
25
保存于棕色玻璃瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
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液相色谱对流动相的要求
液相色谱仪器对流动相的要求∶
– 与检测器匹配 – 脱气 – 避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统） – 溶剂的粘度
– 防止细菌的生长
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流动相的脱气

流动相脱气的目的
– 使色谱泵的输液准确
色谱柱对流动相的要求
– 过滤除去微粒 – 纯度的要求
超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水 有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)， 并与填料相匹配
– 缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内 – 缓冲液（盐）的浓度不要太高(≤100mM) – 流动相对样品的溶解度
调整有机溶剂和水的比例 最好用流动相溶样
面板操作 :
–打开状态(Statas)画 面 –按右下角Direct Function功能键 –选 Dry Pime或 Wet Prime命令 –选OK 即可进行泵的排气
注:
–当流路中充满空气时,
按图示做Dry Prime –若只是更新流动相时, 只须作Wet Prime
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匀的氧化膜
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色谱泵及系统的清洗

清洗液用30%磷酸水溶液
30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀
清洗步骤如下:
– 取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器 – 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) – 用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分钟 (四元泵的A,B,C,D四路各为25%) – 换成清水洗至出口水pH显中性 – 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用
柱塞杆 清洗孔
泵体
排液阀
泵灌注阀
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Waters 2695 分离单元
溶剂瓶盘 检测器接液盘 前面板显示 屏和键盘 软盘驱动器 样品室门 溶剂输送单 元进入门 溶剂配比单元 进入门
注射器箱门 柱温箱
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2695排气操作示意图
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色谱泵及系统的钝化

钝化液用6M硝酸水溶液 6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀 钝化步骤如下:
– – – – – – 在清洗步骤完成后进行钝化处理 确认清洗用的磷酸已基本洗净 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) 用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分钟 换成清水洗至出口水pH显中性 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用