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绘制标准曲线： 按下式计算相对迁移率：
蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 相对迁移率 =
溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对 迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的 迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲 线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定 才具有可靠性。
• 由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介 质，其孔径大小与生物大分子具有相似的数量 级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛 效应。
• PAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳
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聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应
• 凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺 寸和形状
• 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性 是由于它的尺寸筛分能力（size sieving capacity），这种现象被称为分子筛效应 （molecular sieving effect）
• 电泳转移装置：利用低电压，大电流的直 流电场，使凝胶电泳的分离区带或电泳斑 点转移到特定的膜上，如PVDF膜
• 电泳洗脱仪：回收样品
• 凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫 描，从而给出定量的结果。
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Ⅰ常规聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
• 在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离 时，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密 度，还取决于蛋白质的尺寸和形状。
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PAGE的具体操作过程
• 制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓 度和缓冲液），使用灌胶模具灌胶；
• 样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样 品浓度（1~2mg/L，考染），加样（溴酚蓝）；
• 电泳：4~6小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部；
• 检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染 色—灵敏度比考染高100倍、荧光探针）；
• 琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%琼脂糖的孔径为 800nm，可以分析百万道尔顿分子量的大分 子，但分辨率较凝胶电泳低。
• 机械强度高：可以在浓度1%以下使用；
• 无毒； • 染色、脱色程序简单，背景色较低； • 热可逆性； • 生物中性：一般不与生物材料结合。
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电泳系统的基本组成
• 电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳 槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽
• 系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在 一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果。
• 温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高 温度可以是凝胶透明而有弹性。
• 分子氧：分子氧存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气
• 系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合
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B.琼脂糖凝胶的性能、结构与特点
其优点如下：
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区带电泳的主要技术
• 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或 一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介 质上或支持介质中迁移。
• 具有支持介质的区带电泳具有防止电泳过程中 的对流和扩散，可使被分离的成分得到最大分 辨率的分离
• 区带电泳中的常用技术 纸电泳、硝酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳
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未知蛋白质分子量的测定
• 基于SDS-PAGE的原理，可利用SDSPAGE进行未知蛋白质的分子量测定。
• 以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE 电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制 作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同 条件下进行SDS-PAGE电泳，测定相对迁 移率，从标准曲线得到相应的分子量。
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用于等电聚焦的主要载体两性电解质
• Ampholine ，Pharmalyte
• 瑞典LKB公司，瑞典Pharmacia 公司 ，上 海东风试剂厂等
• 不同的产品有不同的pH梯度范围
• 由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构体和 同系物组成，它们具有连续改变的氨基与 羧基比
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pH梯度的形成
• 一般选择缓冲液的离子强度为0.01~0.1 mol/L之间
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凝胶浓度的选择
• 由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷 密度，而且取决于分子的大小、形状。因此， 具有凝胶的分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳 的分辨率、电泳速度密切相关） 。
• 凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳 时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样 位置。
• 电泳迁移率只与分子量有关。
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蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚 和分子形状的改变
形状近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴 长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正 比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不
再受蛋白质原有电荷和形状的影响，
• 蛋白质分子的解聚：
• SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助 溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键， 使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三 级结构。
• 强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使 半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
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SDS-PAGE 的原理
• 在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质 分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨 基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白 质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原 有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异； 同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相 同，这就消除了分子形状对迁移率的影响。
• 照相、凝胶干燥：
• 定量测定：
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Ⅱ SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）
• 主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知 蛋白质分子量的测定。
• 特点：设备简单、操作简便、测定快速、 重复性高、样品无需纯化。
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SDS-PAGE 的原理
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缓冲系统的选择原则
• 通常选择pH 8.0~9.5的缓冲液，常用的缓 冲液有:
• Tris-甘氨酸（pH 8.3~9.5） • Tris-硼酸(pH 8.3~9.3) • Tris-醋酸（pH 7.2~8.5）
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缓冲系统的离子强度的选择
• 离子强度不宜过高，此时电泳速度快； 但也不可过低，必须具有一定的缓冲能 力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮 凝。
• 利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限 于蛋白质和两性分子。
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工作原理
• 蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为 该蛋白的等电点（isoelectric point pI）。
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样品活性恢复方法
• 在凝胶中恢复活性： 只有单体蛋白、有相同亚基组成的蛋白 才能够使用这种恢复方式；异丙醇、醋 酸、水（5/2/13）去除SDS，然后以缓 冲清洗；
• 洗脱后，在自由溶液中恢复活性： 透析袋
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Ⅲ 等电聚焦电泳
• 等电聚焦（isoelectrofocusing）, IEF： 利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点 不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH 梯度中进行蛋白质的分离和分析。
• 凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质 分子均随缓冲液推进，不能得到很好的分离。
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凝胶浓度与分子量大小的关系
凝胶浓度 (C=2.6%)
5 10 15 20
分子量范围 (kDa)
30~200 15~100 10~50
2~15
凝胶浓度 (C=5%)
5 10 15 20
分子量范围 (kDa)
• 当引入电场时，载体两性电解质分子将 向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的 分子（带最多负电）将最快地向阳极移 动；当它达到净电荷为0的位置时才停 止，这个位置靠近阳极，由于它具有高 的缓冲能力，使环境溶液的pH等于分子 本身的pI。
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• pI稍大一些的低pI的载体两性电解质（带 其次多的负电）也向阳极移动，直到它的 净电荷减少到0才停止。同样的，其周围 环境溶液pH值也等于它本身的pI。
• 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据 分子尺寸大小和形状、分子所带电荷等 特性。
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电泳迁移率
• 电泳迁移率（mobilit源自）:在电位强度E的 影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离 （单位电场强度下的泳动速度）。
m= d t⋅E
• 其单位是cm2·sec-1 ·V-1
• 电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离 不同物质的基础
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分子筛效应
+
A
B
-
C
图中A，B，C均为阳离子，在直流电场作用下电泳示意图
分子量大小依次为MA=MB>MC，所带电荷量相同 QA=QB=QC。
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电泳前的准备工作
• 缓冲系统的选择： （1）保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及
生物活性的保持；
（2）从理论上讲PAGE可以在任何pH进 行，但实际上过酸或过碱的条件下将发生 某种水解，因此，pH应限制在3~10之 间。
60~700 22~280 10~200 5~150
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凝胶浓度的选择