文章编号:1009-4237(2007)02-0160-03论　著原浆型和纤维型星形胶质细胞调控神经干细胞定向分化的比较研究曾　琳,李　民,刘　媛,龙在云,李书林,伍亚民(第三军医大学大坪医院野战外科研究所三室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆　400042)摘要:　目的　探讨原浆型星形胶质细胞(pro t op l as m ic astrocy t e ,PAS )和纤维型星形胶质细胞(fi brous astrocy t e ,FA S )对神经干细胞(neura l ste m ce ll ,N SC )定向分化的调控作用。

方法　将4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-D ia m i dino -2-phenyindo l e ,dilac t a t e ,DAP I )标记的NSC 分别与PAS 、FAS 共培养,10天后免疫组化法对分化神经元进行鉴定,显微镜下随机选取20个视野,每次计数100个细胞,计算NSC 分化为神经元的比例。

结果　N SC 与PA S 共培养后分化成的神经元比例较高,与胶质细胞的比例约为61%:39%;FA S 与N SC 共培养后分化神经元数量相对较少,以胶质细胞居多,其比例约为41%∶59%。

结论　PA S 与FA S 相比更能促进NSC 向神经元分化。

关键词:星形胶质细胞;神经干细胞;分化中图分类号:R 338 文献标识码:AStud ies on regulatory effects of t he protoplas m ic and fi b rous astrocytes to thed irectional differentiation of neura l ste m cellZ ENG lin ,LI M in ,L I U Y uan ,et al .(S tate K ey L aboratory of T rau m a ,Bu rns and Co m bined In j ury ,D epa rt m entN o.3,Institute of Su rgery R esearch ,Daping H ospit a l ,ThirdM ilitary M ed ica l Un i ve rsit y ,Chongqi ng 400042,Chi na )Ab stract :　O b jective To study t he regula t o ry eff ec t o f pro toplas m ic astrocy te (PAS )and fibrous astrocy t e (FAS )on differentiation of neural ste m ce ll (N SC ).M ethod s I mmunohist o che m isty w it h DA P I wa s taken to cal -cu l a t e the proporti on of neurons w it h i n 100cells by 20fie l ds of v isi on chosen random ly fo r 10days .The da t a w ere analyzed in statistics by co -cu lt u re of N SC w it h PAS and FAS respec tiv l y .Resu lts The percentage of neurons in PA S group (61%)w asm uch m ore t han t hat of FA S g roup (41%).Con clusion The result sugge sted t ha tPA S w as m ore eff ec tive t o induce NSC diff e renti a ting into neuron in vitro .K ey word s :astrocy t e ;neu ra l st em cell ;d iffe rentia tion基金项目:国家自然科学基金(30300364) 重庆市院士基金(7671)收稿日期:2006-08-06;修回日期:2006-11-03通讯作者:伍亚民(第三军医大学大坪医院野战外科 研究所三室,重庆　400042) 星形胶质细胞(astrocyte ,AS )能分泌多种细胞因子[1-3],调控神经干细胞(neura l ste m ce ll ,NSC )分化,而原浆型(protoplas m ic astrocy t e ,PAS )和纤维型星形胶质细胞(fibrous astrocy t e ,FAS )又存在一定的功能差异[4],对NSC 分化可能产生不同的作用。

为此,本实验探讨以上两种AS 对NSC 向神经元分化的不同作用,从而为细胞联合移植治疗脊髓损伤奠定基础。

材料与方法1　实验动物孕13～14天的大鼠和新生2天的大鼠。

2　试剂与材料胎牛血清(FBS ,H yclone ),2mm o l /L L -谷氨酰胺(Sig m a ),0.6%葡萄糖,DME M /F 12培养基(H y -clone ),多聚赖氨酸,0.25%胰蛋白酶(S i g m a ),10mm o l /L L -l e uc i n e -m e t h y l -este r (S ig m a ),0.15mm o l /L E DT A ,H anks 液(自备),兔抗大鼠GF AP (Sig -m a ),小鼠抗大鼠NF -200(S i g m a ),羊抗兔TRI TC 、羊抗小鼠TR I TC 、0.4%Triton -X -100、甲醇、30%H 2O 2、0.01M PBS (北京中山公司)。

3　实验方法3.1　PAS 和FAS 的纯化培养参见Raff 等[4]的培养方法。

3.2　PAS 和FAS 的鉴定　将上述细胞固定后,用0.5%H 2O 2/纯甲醇灭活内源性过氧化物酶,0.4%Trit o n -X -100处理,滴加正常山羊血清封闭,加入GFAP 抗体37℃孵育2小时,用羊抗兔TRI TC Ig G 荧光抗体显色后DPX 封片,激光共聚焦显微镜观察,激发波长为543nm ,呈红色。

3.3　NSC 的培养和鉴定　参见本单位刘媛等建立的方法[5]。

3.4　NSC与两种AS共培养3.4.1　分组　NSC与PAS共培养组;NSC与FAS 共培养组;单纯NSC培养对照组;各组培养基均选用含5%FBS的DME M/F12培养基,培养10天。

3.4.2　NSC分化情况鉴定　经DAPI标记的NSC 分化10天后,用NF-200对分化神经元进行标记,用TRI TC显色,方法同1.3.2部分。

激光共聚焦显微镜观察,激发波长为543nm阳性细胞,为红色。

DA-PI标记为蓝色,激发波长为380n m。

4　统计学处理在显微镜下随机选取20个视野,每次计数100个细胞,计算神经元在NSC中所占的比例。

实验数据用SPSS10.0软件处理,结果以–x±s表示,组间差异采用单因素方差分析。

结　果1　PAS、FAS免疫组化结果分析GF AP免疫组化方法观察到两种分离纯化的细胞均特异性的标记为阳性,呈红色荧光,显示为胞浆着色。

P AS和FAS在形态上差异明显:PAS外观扁平似圆盘状,胞体较大,突起宽而扁,分支少,均匀排列生长;FAS胞体较小,呈圆形、卵圆形或多角形,突起较多,细长并有分支,呈交错生长(图1)。

根据细胞形态进行纯度检测,纯化后的细胞纯度均>95%。

2　NSC与PAS、FAS共培养后分化比例分析PAS饲养条件下培养的NSC经诱导,分化成的神经元比例较高,与胶质细胞的比例约为61%∶39%;FAS与NSC共培养分化出的神经元数量相对较少,以胶质细胞居多,其分化比例约为41%∶59%;DME M/F12+5%FBS诱导NSC分化为神经元和胶质细胞的比例介于前两组之间,约为51%∶49%(表1、图2、图3)。

表1　NSC与两种A S共培养后的分化比例(%)(–x±s) 分组神经元胶质细胞PAS(n=20)61.20±3.9738.80±3.97 FAS(n=20)41.15±4.76##58.85±4.76##D/F+5%FBS(n=20)50.75±5.31##△△49.25±5.31##△△ 与A组比较:#P<0.05,##P<0.01;与B组比较:△P< 0.05,△△P<0.01a.PAS GFAP(红色)荧光标记,圆盘状,突起宽而扁;b.FA S G FA P(红色)荧光标记,多角形,突起细长有分支　图1　两种星形胶质细胞组化鉴定共聚焦显微镜观察图2　神经干细胞与不同类型星形胶质细胞共培养后的分化比例a.N SC、PA S共培养10天分化神经元染色;b.N SC、FAS共培养10天分化神经元染色;c.N SC在含5%FBS的D ME M/F12诱导10天分化神经元染色。

[DA P I(蓝色)标记N SC核;NF-200(红色)标记神经元;神经元分化比例a组高于c组,c组高于b组]图3　神经干细胞分别与两种星形胶质细胞共培养10天后的分化神经元组化鉴定元和胶质细胞[6],目前有研究证实雪旺氏细胞、AS 能够促进NSC的分化[7]。

而有关不同类型AS对NSC存活及其分化影响方面的研究鲜有报道。

本实验观察到,在两种AS饲养以及含血清培养基的诱导作用下,NSC均发生分化,10天左右分化成熟。

其中P AS组NSC分化为神经元的比例(61%)明显高于D M E M/F12+5%FBS组(51%),而FAS组NSC分化为神经元的比例(41%)明显低于D M E M/ F12+5%FBS组。

这些观察结果表明,PAS促进了NSC主要向神经元方向的分化,而FAS促进了NSC 主要向胶质细胞方向的分化。

作者认为,这可能与AS能够合成和分泌多种神经营养因子和细胞生长因子有关。

已知AS能够分泌的生长因子有:表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(I G F)、转化生长因子-β(TGF-β)、胶质细胞成熟因子、内皮素等;神经营养因子有:神经生长因子(NGF)、睫状节神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素(NT)等。

有研究表明,B D-NF、TGF-β、PDGF和I G F可诱导NSC分化为神经元[4],而CNTF、E GF促进NSC向胶质细胞分化[8]。