绿色荧光蛋白研究进展动物医学进展,2008,29(1):56259Progress in Veterinary Medicine绿色荧光蛋白研究进展王晓丽1,邵卫星2,单虎13(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266071)摘要:来源于海洋多管水母属的绿色荧光蛋白(GFP)基因是目前惟一在细胞内稳定表达,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因,无种属、组织和位置特异性,且能监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等。
GFP对细胞无毒性,且检测方法简单,结果真实可靠,目前在多种原核和真核生物研究中得到广泛的应用。
文章就GFP 的生化特性、GFP的改进及其在分子生物学研究中的应用潜力进行简要阐述。
关键词:绿色荧光蛋白;选择标记基因;应用中图分类号:Q516文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0120056204随着生命科学和医学研究的不断深入,研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因,目前常用的报告基因主要有分泌型胎盘磷酸酯酶(secreted embryo alkaline p ho sp hatase, SEA P)基因、β2半乳糖苷酶(galactosidase)基因、β2葡糖苷酸酶(glucosidase,GU S)基因、萤火虫荧光素酶(luciferase,L UC)基因等[1],但这些基因的检测方法并不理想,它们都需要底物和辅助因子,因而在活体中的应用受到限制。
一种全新的非酶性报告基因———绿色荧光蛋白(green fluorescent p rotein, GFP)引起了人们的关注[2],该蛋白能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿色荧光。
作为报告基因,GFP是能在活细胞中表达的发光蛋白;作为荧光标记分子,GFP既具有敏感的标记检测率,收稿日期:2007210218作者简介:王晓丽(1981-),女,山东威海人,硕士研究生,主要从事预防兽医学研究。
3通讯作者[19] Mammina C,Pontello M,Dal Vecchio A,et al.Identigica2tion of Shigella sonnei biotype g isolates carrying class2inte2 grons in Italy(200122003)[J].J Clin Mirobiol,2005,43:246722470.[20] Mammina C,Aloe A,Romani C,et al.Shigella sonnei bio2type G carrying class2integrons in sout hern Italy:a retro2spective typing study by pulsed gield gel electrophoresis[J].BMC Infect Dis,2006,(6):117.Advance in G ene C assett2Integron System of B acteriaWEI Shu2yong1,WU Deng2hong1,L IU Shi2dong2(1.V eterinary Depart ment,S out hwestern Uni versit y Rongchang Cam pus,Chongqing,402460,China;2.Forest Enterp rise of L inyi,L inyi,S handong,276000,Chi na)Abstract:Gene cassette is a minor2movable deoxyribonucleic acid(DNA)molecule,and usually is t ran2 scribed wit h a integro n.Integron is a conservative and movable transposon2like DNA element,which can make a horizontal transmission of drug resistance gene and has a great cont ribution on t he diff usion of drug resistance gene among bacteria and t he production of multidrug resistance.Since t he concept of gene cas2 sette and integro was p roduced,new types of integron was detected continuously.At p resent,t hree types of integron were generally accepted and named typeⅠ,typeⅡand typeⅢ.TypeⅠintegron has a more de2 tection and deep research.This article summarizesd t he origin,st ruct ure,categorization,expression,bio2 logical detection and t he relationship between bacterial drug resistance and t he recentadvance in gene cas2 sett2integron system of bacteria.K ey w ords:gene cassette;integro;drug resistance又没有放射性的危害。
而且新的研究表明,GFP是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子,可以跟踪观测第二信使[3]。
近来关于GFP 方面的研究和综述越来越多,但多是针对某一方面的特点或应用,本文将GFP基础理论和应用做一简要综述。
1 GFP的生化性质1962年,Shimomura O等首次从多管水母属(Aequorea victoria)中分离纯化出了GFP,随后人们对GFP进行了广泛研究,目前研究得较为深入的是来自多管水母科(Aequorea)和海紫罗兰科(Re2 nilla)的荧光蛋白,即A2GFP和R2GFP。
A2GFP是分子质量为27ku～30ku的蛋白单体,R2GFP是分子质量为54ku的同型二聚体,二者都是酸性球状蛋白质,氨基酸组成相似,发射光谱基本相同,但激发光谱不同。
A2GFP在395nm和470nm具有吸收高峰,R2GFP在498nm具有强烈的光吸收。
只有完整的GFP分子才会产生生物荧光,但与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为色基(Chromop hore)的部位。
在GFP 的初级氨基酸序列上,第65个至第67个氨基酸(Ser2Tyr2Gly)形成环状六肽三体,以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连[4]。
色基形成的机理目前尚不清楚,但在有分子氧存在的条件下,酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸,并环化形成六肽,这可能是形成色基的必然过程。
Shimo2 mura O最先推导了水母GFP色基结构,后来进行了进一步验证与修改。
GFP的cDNA 克隆序列分析表明,在2.6kb范围内至少分布有3个启动子,组成色基的Ser2Tyr2Gly三体就位于第2个内含子3′端。
GFP用作标记蛋白,具有以下优点:①荧光稳定。
GFP对光漂白有较强的耐受性,能耐受长时间的光照;GFP在p H7～12范围内也能正常发光[5];对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶(链霉蛋白酶Pronase除外)都有较强抗性。
②检测方便。
用荧光显微镜或肉眼就可以观察到,且可进行活体观察,不会损伤正在生长的细胞和组织[6];③无种属特异性,也没有细胞种类和位置的限制,Chalfie M等用PCR 方法扩增GFP cDNA 后,克隆到原核表达载体上,转化大肠埃希菌,经IP T G诱导后,在紫外光照射下转化细菌能发出绿色荧光;④GFP对受体细胞基本无毒害。
Sheen J 等[7]证实在玉米转GFP基因植株中,即使GFP 在细胞中的表达量很高时,对细胞也不会产生明显毒害;⑤不受假阳性干扰。
由于其他生物本身不含有GFP,因此不会出现假阳性结果,GFP作为分子探针可以代替荧光染料避免由于染料扩散造成的定位不准,使结果真实可靠;⑥不需任何反应底物和辅助因子;⑦可制成永久标本。
GFP的荧光可以耐受光漂白,也可耐受福尔马林的固定,因而可制成长期保存的标本;⑧灵敏度高。
GFP标记方法比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率。
尽管GFP基因作为报告基因或分子探针有许多优点,但野生型GFP 发光较弱,其次荧光反应不是酶反应,不能通过添加某些物质来加强信号,且不易对荧光进行定量检测。
另一方面,GFP基因在植物细胞内的表达频率并不高,甚至在某些植物细胞中并不表达。
2 GFP基因的改进目前主要通过以下几个途径得到突变体GFP[8]:①更换GFP生色团氨基酸;②改变碱基组成;③除去GFP基因中隐蔽剪接位点;④插入植物内含子;⑤更换强启动子等突变体GFP;⑥增加荧光强度和热稳定性,促进了生色团的折叠,其荧光特性也得到了改善[9],甚至出现红色、黄绿色、蓝色等多种颜色的荧光蛋白,大大拓宽了GFP研究的领域。
以下是GFP 突变体的部分典型代表:①增强型GFP。
Guohon S等将Ser65用Thr 替代,Phe64用Leu替代,使GFP的荧光强度提高了35倍,而且激发后16h～24h后仍可稳定地测定荧光;②人工GFP。
Zolot ukhin S等改变了wt GFP基因编码区中88个密码子中的92个碱基而用人类基因组中常用的密码子代替,将GFP的荧光强度提高22倍,适合在哺乳动物细胞中高效表达;③红移荧光蛋白。
将wt GFP中的Ser65用Thr替代,得到突变体。
S65T2GFP,激发谱中只有一个峰,且红移至490nm,用蓝光即可激发RSFP,使之更适于普通荧光显微镜观察;④蓝色荧光蛋白。
双突变体Y66H/ Y145F能在381nm光的激发下产生445nm的蓝光,这种蓝光还能进一步激发GFP产生绿光,即发生荧光共振能量转移现象,为不同蛋白质之间及细胞器之间的相互作用研究开辟了更为广阔的视野。
除以上类型的GFP突变体以外,人们还通过定点突变得到了一些可用作指示剂的GFP突变型,如p H 敏感GFP,可被用来测量细胞器或更小颗粒的p H,并记录其变化,最近利用靶入了水母GFP基因的丝蛋白昆虫病毒,感染蚕的幼虫,用改造的基因取代了蚕的正常基因,当蚕吐丝时,这种丝是一种能在黑暗中发绿色荧光的纤维。