2019年度安徽省科技进步奖亳州市提名项目公示（一）项目名称浓香型白酒产业酿造微生物优化组合关键技术研究及应用（二）提名意见该项目是由安徽古井贡酒股份有限公司、哈尔滨工业大学（威海）、安徽工程大学、安徽瑞思威尔科技有限公司共同合作完成的重大应用科研项目。
该项目以中国浓香型白酒代表古井贡酒的酿造过程为研究对象，通过解析其生产过程中的微生物菌群分布规律及其功能，筛选优良菌株并进行优化组合，投入到生产实际中提高了浓香型白酒酿造品质，促进白酒由生产经验型的操作应用提升到微生物定向代谢风味品质调控技术层面，形成成熟的应用技术。
该项目研究成果已经成功在4家浓香型白酒企业和1家科技公司应用，累计创造直接经济效益33.36亿元，节约成本8050万元。
该项目技术提高了现代酿造的生产效率、酿造质量，为浓香型白酒产业制造高端优质产品提供了技术支持，进一步推动我省白酒产业健康、稳步和可持续发展，促进浓香型白酒产业的提质升级。
项目材料填写规范，内容真实，经公示无异议。
对照国家科学技术进步奖授奖条件，同意该项目提名为2019年度安徽省科学技术进步奖。
（三）项目简介项目“浓香型白酒产业酿造微生物优化组合关键技术研究及应用”综合运用现代生物技术、发酵工程、风味化学等多项技术，对浓香型白酒生产过程中的酿造体系进行深入研究，解析了大曲、窖泥和酒醅基本的微生物群落结构，系统分析白酒酿造过程中的微生物菌群分布及代谢规律，筛选出酿造过程中的优良菌株，根据菌株理化性质及代谢特征分析，通过优化功能微生物的组合方式，调控酿酒过程中菌群结构和代谢方式，应用到生产过程中能够有效的提高白酒酿造品质。
1、项目主要技术内容（1）研究了以古井贡酒为代表的浓香型白酒酿造过程中大曲、酒醅、窖泥微生物群落结构，总结出浓香型白酒生产过程中酿造微生物群落的两段式作用模式，阐明了窖泥微生物结构影响酿酒质量的机理，形成了提升浓香型白酒品质的关键技术。
（2）通过比较优质窖泥与普通窖泥中微生物群落组成的差异和酒样中风味物质组成的差异，结合数据的关联分析，得到了优质窖泥微生物含量较多的5个菌属，阐明了浓香型白酒酿造过程中微生物群落的变化规律和发酵差异规律，用于指导浓香型白酒生产过程中窖池的养护、改善和提升。
（3）基于MAFFT多序列比对和核糖体RNA基因全长筛选特异性SNP位点，通过扩展型SAP技术，对白酒发酵过程中不同分类层级的微生物菌群进行特异性扩增，实现发酵过程中任意时间点或工艺环节中的微生物群落的宏观结构变化的快速测定。
（4）综合利用生物信息学分析技术、厌氧微生物筛选技术、代谢产物组学分析等多项技术，获得有效提升浓香型白酒品质的窖泥功能性微生物、大曲功能性微生物，并应用到浓香型白酒生产过程中。
（5）选育出窖泥中能够提升浓香型白酒品质的优质菌属（种），研制了两种提高浓香型白酒固态发酵过程中己酸乙酯含量的技术方法，“菌球”方法能够将原酒中己酸乙酯的含量提高40-60%，“窖泥养护液”方法可提高15-30%。
2、知识产权及技术指标已授权6项国家发明专利、4项实用新型专利，另有10项发明专利已受理；主持制定安徽省地方标准3项；部分技术研究成果通过4项安徽省科技成果鉴定，获得2项亳州市科技奖；获得CCTCC菌种保藏号3株，发表学术论文23篇。
3、应用推广及经济、社会效益情况经评价委员会认定，该成果总体技术水平达到国内领先。
该项目研究成果已经成功在4家浓香型白酒企业和1家科技公司应用，累计创造直接经济效益33.36亿元，节约成本8050万元。
该项目技术提高了现代酿造的生产效率、酿造质量，为浓香型白酒产业制造高端优质产品提供了技术支持，进一步推动我省白酒产业健康、稳步和可持续发展，促进浓香型白酒产业的提质升级。
（四）主要科技创新（1）项目关键技术1）浓香型白酒酿造菌群多样性及多维数据关联分析研究技术浓香型白酒的酿造生产过程中，原酒质量的变化实际上是白酒中各种呈香物质组成的变化，根本上还是由于酿酒微生物群落组成的变化导致的。
酿酒微生物群落始终处于相对稳定的动态变化中，在一定程度上酿酒就是培养微生物获取其代谢产物的过程。
通过综合运用了色谱分析、统计分析、生物学信息分析、高通量测序等多种技术，对浓香型白酒生产所用大曲样本，不同产区多个生产排次的原酒、窖泥、酒醅样本进行分析，分别从不同维度对浓香型白酒酿造过程中微生物群落的多样性进行了研究，系统性的分析了白酒酿造过程中的微生物菌群分布规律。
结合酒样品评数据以及窖泥代谢组学分析数据之间的关联性分析，获得了主要酒体风味成分和微生物菌群结构特征之间的相关性数据，总结出浓香型白酒生产过程中酿造微生物群落的两段式作用模式，阐明了窖泥微生物结构影响酿酒质量的机理，形成了提升浓香型白酒品质的关键技术。
2）创新性研制一套针对窖泥微生物不同分类层级群落结构快速定量技术基于MAFFT多序列比对和核糖体RNA基因全长筛选特异性SNP位点，通过扩展型SAP技术研制了一套可以特异性区分浓香型白酒窖泥菌群任意分类层级的方法，设计了针对浓香型白酒窖泥主要微生物的总细菌定量引物、5对门特异性引物、4对属特异性引物、11对种特异性引物，可对发酵过程中任意时间点或工艺环节中的微生物群落的宏观结构变化进行快速测定，实现了对酿酒微生物群落随时快速监测，对酿酒质量起到预警作用，能够及时指导窖泥定向保养维护，维持窖泥稳定平衡的微生物区系。
3）浓香型白酒酿造微生物优化组合应用关键技术通过结合可培养和未培养微生物技术，对浓香型白酒大曲和窖泥中优势微生物菌群进行了深入研究和分析，研究了纯培养微生物发酵产物。
通过大曲微生物的分离筛选，选育出酿酒酵母、解淀粉芽孢杆菌、Ruminococcaceae bacterium CPB6（瘤胃菌科-梭菌CPB6）、Caproiciproducens（产己酸细菌）等多株优良发酵菌种。
研制了两种提高浓香型白酒固态发酵过程中己酸乙酯含量的混菌制剂制备方法。
一种是“菌球”混菌制剂，另外一种“窖泥养护液”混菌制剂。
利用“菌球”投放或“窖泥养护液”应用到浓香型白酒生产中，起到维持窖泥稳定平衡的微生物区系，对新建或退化窖池能够快速达到优质老窖池发酵效果，提高原酒中己酸乙酯含量，对传统浓香型工艺进行改造与优化，提升浓香型白酒品质。
（2）项目技术内容及创新点创新点1：创新浓香型白酒酿造微生物优化组合方式，开发了“菌球”和“窖泥养护液”两种关键技术，提高了浓香型白酒固态发酵过程中己酸乙酯的含量。
（本创新属于发酵工程（亦称微生物工程），代码：1807150，附件材料见）使用窖泥中能够提升浓香型白酒品质的优质菌属（种），研制了两种提高浓香型白酒固态发酵过程中己酸乙酯含量的技术方法。
混合菌制剂“菌球”，利用窖池底部的优势厌氧菌种反刍球菌细菌CPB6、酪丁酸梭菌、乳酸杆菌、木犀科细菌和拜氏梭菌根据车间实际需求，通过营养液、培养基、菌悬液的配制，按照一定比例进行混菌培养并制备成“菌球”，针对各酿酒车间己酸乙酯含量低的窖池底部进行投放使用。
“菌球”可以把厌氧菌与外界空气之间实现足够程度的隔离，可以保障有一定比例的厌氧菌在投放窖池前处于成活状态。
菌球的使用对厌氧优势菌进行包裹有其一定的创新性。
厌氧菌种难以培养和实践操作的最重要原因是厌氧条件难以满足，成本较高。
“菌球”可以解决菌属的厌氧培养问题，且制备过程简单，原材料成本低，具备大规模制备的潜力，快速实现新窖池窖泥质量的提升。
“菌球”方法能够将窖泥中Lactobacillus乳酸杆菌的含量降低30-50%，而益于提升浓香型白酒品质的优势菌Clostridium、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Syntrophomonas、Aminobacterium、Caproiciproducens的含量增幅20-50%。
“菌球”方法能够将原酒中己酸乙酯的含量提高40-60%，此外酒样中其他酯含量均有不同程度提高，如庚酸乙酯、己酸丁酯、辛酸乙酯、乙酸异戊酯等有机酸酯系列物质的含量增幅10-50%，而乳酸己酯含量增幅（-30）-5%，利用分离得到的窖池底部的优势厌氧菌种制备出的混菌制剂“窖泥养护液”，配送至各酿酒生产车间使用，用于窖池养护。
“窖泥养护液”方法可将原酒中己酸乙酯的含量提高15-30%，乳酸乙酯的含量增幅（-10）-10%。
两种技术均对所产原酒起到“增己降乳”的成效，已成功应用于浓香型白酒的生产中。
其中，“菌球”方法应用到普通窖池、退化窖池和新建窖池，“窖泥养护液”则可用于各生产排次养护中，所产原酒经国家级白酒评委进行专业品评，白酒评估所产原酒窖香纯正，味甜纯，较醇厚，尾净爽，余味长，使得酒体的口感风格更加突出。
创新点2：结合可培养和未培养微生物技术，对浓香型白酒大曲和窖泥中优势微生物菌群进行了分离和筛选，研究了纯培养微生物发酵产物。
（本创新属于应用微生物，代码：1806150，附件材料见）综合利用生物信息学分析技术、厌氧微生物筛选技术、代谢产物组学分析等多项技术，筛选出有效提升浓香型白酒品质的窖泥功能性微生物、大曲功能性微生物。
其中大曲微生物109株，其中细菌55株、酵母菌43株、霉菌11株，窖泥微生物82株细菌。
基于纯种分离技术的浓香型白酒大曲微生物分离鉴定及代谢分析，选育出功能性微生物如耐高温的酿酒酵母（耐高温45℃、耐酸pH 2.0、耐乙醇18%vol）、高产酯的异常威克汉姆酵母（高产乙酸乙酯3796mg/L）等多株优良发酵菌种，并对菌种进行了产酸和产酶等研究，分别对酵母菌种发酵产物分析、发酵产CMC、糖化酶、α-淀粉酶等酶活的研究，对于纤维素酶，酶活最高的为黑曲霉。
基于纯种分离技术的浓香型白酒窖泥微生物分离鉴定及代谢分析，通过结合传统微生物纯培养分离、筛选、鉴定、创新厌氧分离筛选以及现代分子生物学技术共获得窖泥微生物82株，选育出功能性微生物如高产3-羟基-2-丁酮的解淀粉芽孢杆菌、产己酸的Ruminococcaceae bacterium CPB6（瘤胃菌科-梭菌CPB6）、Caproiciproducens等多株优良发酵菌种。
获得保藏号菌种3株（解淀粉芽孢杆菌GJJNBL004（Bacillus amyloliquefacien s），保藏编号CCTCC NO：M2014494；异常毕赤酵母GJYL08（Pichia anomala），保藏编号CCTCC NO：M2015109；酿酒酵母GJYD02（Saccharomyces cerevisiae），保藏编号CCTCC NO：M2017132）。
得到老窖池窖泥与新窖池窖泥的菌群组成差异，厌氧培养得到的菌种在新老窖池窖泥中的主要差异菌种是Ruminococcaceae bacterium CPB6，Clostridiumtyrobutyricum和Lachnospiraceae bacterium BTY6。