包虫病的疫苗研究进展*章家新 傅玉才(汕头大学医学院寄生虫学教研室 广东 汕头 515031)提要 免疫预防是防止包虫病流行的比较理想的途径。

用现代分子生物学技术对细粒棘球绦虫的有效免疫原成份进行筛选和克隆,制备基因工程疫苗,为包虫病的免疫预防和免疫诊断开辟了新途径。

本文仅就囊性包虫病近年来的疫苗研究进展作一综述。

关键词 免疫预防;细粒棘球蚴;疫苗;包虫病中图分类号 R18 R532 32[文献标识码]A[文章编号]1007-4716(2002)02-0118-03收稿日期:2002-03-01*基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170710)作者简介:章家新(1974-),男,安徽省全椒县人,在读硕士生。

包虫病又称棘球蚴病,是一种严重危害人畜健康的人兽共患寄生虫病。

本病由棘球属绦虫的中绦期幼虫引起。

其中细粒棘球绦虫[引起人囊性包虫病(囊性棘球蚴病)]和多房棘球绦虫[引起人泡型包虫病(泡型棘球蚴病)]分布广,可在人体内引起严重病变。

另外,伏氏棘球绦虫偶尔可在人体内引起多囊性棘球蚴病,少节棘球绦虫尚无人体内感染的确切报道。

在我国只有前2种,而绝大多数流行区以囊性包虫病为主。

1 流行病学包虫病是我国北方地区的一种严重寄生虫病,已证实[1]25个省、市和自治区有感染病例。

甘肃、新疆、宁夏、内蒙古、青海、四川、陕西和西藏流行严重[2],其中新疆、青海、甘肃、宁夏等地的细粒棘球蚴属于同一虫株[3]。

黑龙江、河北、天津、安徽、山东、湖南、贵州、上海等地已发现有原发包虫病人,说明随着现代社会的发展,人口流动的增加,宠物(犬)和经济动物(狐狸)养殖数量增加,包虫病已从我国的西北部向东南部、由畜牧地区向农业地区逐渐蔓延。

目前我国包虫病患者约100万,受威胁人口几千万。

2 疫苗预防的必要性我国是包虫病发病率最高的国家之一[4]。

控制包虫病的流行主要是通过切断棘球绦虫生活发育环节,预防中间宿主(人,畜)对棘球蚴的感染,预防或驱虫治疗终宿主(犬),阻断虫卵的播散。

在新西兰和澳大利亚以驱虫治犬和宣传教育,取得了较好的效果。

我国在感染流行的重点省份,制定防治规划,查治病人,捕杀野犬,对试点区实行 月月驱虫,犬犬投药 ,使棘球蚴病得以很好的控制[5]。

但就西北牧区而言,那里的经济发展落后,大多牧区处在山区或荒漠和半荒漠地区,牧民多以游牧为主,他们的某些传统生活习俗及缺乏相应的科学文化知识等因素增加了综合防治措施实施的难度,使各实验地区的综合防治经验未能持续推广下去[6]。

由于许多相邻国家和地区有棘球蚴病流行,在边界地区防治工作又相对较弱,是已控制地区容易输入新的传染源而使棘球蚴病难以获得持久控制的一个主要原因,必须清除传染源才能巩固防治成果。

随着现代生物技术的日新月异,研制各种疫苗的条件已经成熟。

与现行的控制模式相比,采用疫苗预防不仅可以节约大量人力和财力,也能彻底控制包虫病在我国牧区的流行。

3 疫苗的研究制备疫苗的抗原主要有原头蚴或六钩蚴人工培养时的代谢产物和射线照射致弱的活虫。

3 1 中间宿主(羊)的保护性疫苗 国外在控制包虫病流行方面取得了较理想的效果。

将体外培养细粒棘球绦虫六钩蚴的排泄或分泌产物作成抗原,给绵羊接种可获得抗细粒棘球绦虫卵的高度免疫力[7],已证明[8]六钩蚴能产生所有的宿主保护性抗原。

目前主要是应用EG95重组蛋白疫苗防治细粒棘球蚴感染中间宿主(羊)并取得较理想的结果[9,10]。

研究[9,10]发现经EG95重组蛋白疫苗免疫的中间宿主(羊),可以抵抗不同的细粒棘球蚴株(新西兰株、澳大利亚株和阿根廷株)感染,获得良好的免疫保护作用(96%~98%)。

EG95免疫羊产生的特异性抗体是针对天然六钩蚴抗原和所用免疫原中近23kDa 的抗原组分的。

序列分析说明EG95cD -NA 是715bp 的插入片段,编码分子量为16 592kDa118 第15卷 第2期2002汕头大学医学院学报Journal of Sh antou University Medical CollegeVol 15 No 22002的蛋白质,较天然抗原分子量小,该EG95cDNA 未包括5 端的非翻译区和起始的蛋氨酸,提示该克隆不是一个完整的mRNA拷贝[9]。

利用DNA重组技术,可产生大量的可供制备疫苗的重组蛋白质。

在阿根廷和我国完成的试验结果表明,在第2次接种疫苗后,获得的高度免疫至少能持续1年。

这种免疫可以由预防接种的母体经乳汁传输给幼体。

EG95疫苗作用的主要机理是抗体和补体介导的六钩蚴溶胞作用[9],但是对于抗不同包虫病感染的有效性和在不同物种中的保护效果,仍需进一步的研究。

3 2 终宿主(犬)的保护性疫苗 由于牧犬的数量远小于牲畜的数量,对终宿主(犬)实施疫苗预防更经济,更有利于实施,因此用免疫预防控制终宿主(犬)被认为是防止包虫病流行比较理想的途径之一。

Aminghanov[11]用射线照射、冷冻干粉等不同方法处理后的原头蚴抗原免疫犬,免疫次数不同和犬龄不同的犬所获得免疫力亦不一致。

成年犬的免疫效果优于幼犬,免疫4~5次的效果优于2~3次。

薛弘燮等[12]于1993~1994年用细粒棘球绦虫活原头蚴匀浆免疫7~8个月月龄的成年犬,免疫注射2次,可使犬产生较好的不完全抗细粒棘球绦虫攻击感染的能力,并对体内虫体发育产生显著的抑制作用。

但那些发育受到抑制的虫体在犬体内能否进一步发育成熟?抗原刺激犬产生的免疫力能维持多久?这方面的研究报道较少。

Kalinna等[13]研究表明寄生虫肌纤维蛋白具有良好的免疫原性,副肌球蛋白已被确定为血吸虫病疫苗研制的重要蛋白之一。

Fu等[14]用感染犬血清在一细粒棘球绦虫cD-NA表达文库中筛选出一66kDa蛋白cDNA克隆EgA31。

该蛋白定位于虫体的表皮、皮内和皮下肌层,特别在幼体成虫的吸盘上浓度最高。

序列分析提示它不是该虫的副肌球蛋白,但它与副肌球蛋白有很高的同源性,推测EgA31可能是肌纤维蛋白家族成员之一。

用EgA31重组抗原免疫犬,能引起犬显著的体液和细胞免疫反应[15]。

E gA31有可能成为重要的疫苗候选分子,国内正在开展相关的研究工作。

4 疫苗的制备取得大量免疫原以生产疫苗的途径之一是基因工程技术。

基因疫苗又称DNA疫苗,是90年代发展起来的免疫新技术。

它是将一段编码特异靶抗原的基因片段克隆到特定的表达载体中,构建成能够在真核细胞中表达的质粒DNA,将该质粒DNA去接种免疫动物,使抗原基因在动物体内表达,激活机体的免疫系统,能够产生相应的特异性免疫应答。

由于注入动物体的是质粒DNA,其在宿主细胞内表达目的抗原。

抗原经与自然感染相似的过程加工、修饰后,可引发特异性的细胞免疫和体液免疫[16]。

真核表达系统能够产生重组蛋白,提供糖基化的抗原,尽管这种抗原的糖基化方式可能与天然的蛋白不完全相同。

基因疫苗在体内为真核天然表达,不需要体外表达、纯化等繁琐工作并且克服了蛋白质疫苗不易长期保存和免疫原性差的不足,它具有制备简单、携带方便,廉价和容易保存等优点,所以基因疫苗作为一种新型疫苗已引起人们广泛的注意,与传统疫苗相比具有明显的优势[17]。

Rothel等[18]报道了核酸疫苗45W在羊抗囊虫感染中的应用。

途径之二是以c DNA技术,获得蛋白质疫苗。

如EG95重组蛋白疫苗的制备[9]:成熟的细粒棘球蚴虫卵经活化后提出RNA,经纤维柱分离出mRNA,将其反转录成cDNA后克隆到Un-i ZAP XR载体上,将其扩增。

应用超免疫羊抗六钩蚴血清初筛,再用亲和纯化的抗23/25kDa抗体复筛,获得的阳性克隆亚克隆到pGEX-3质粒上,EG95 pGEX-E 转化大肠杆菌进行诱导表达。

途径之三就是通过细胞工程从棘球蚴病人的包囊分离棘球蚴细胞,经体外培养获得细粒棘球蚴细胞系,并扩大增殖培养。

通过体外培育棘球蚴细胞系可以不受限制地提供特异性抗原(细胞系细胞及其代谢/分泌产物),不仅为研制疫苗开展免疫预防提供条件,而且可以观察棘球蚴的发育代谢特性和建立药物筛选的体外模型[19]。

目前,由于尚未完善适宜棘球绦虫细胞体外培养的条件,相关的资料又十分有限,因此培养的成功率很低,有待进一步探讨。

5 展望随着分子生物学和免疫学技术的不断发展,终宿主疫苗研究的成功必将成为可能。

在绵羊中获得如此成功的抗棘球蚴病的免疫接种试验,可作为发展人体疫苗的模型。

一些国家正在准备用E G95抗原对人体进行临床试验。

疫苗预防将为彻底控制包虫病发挥重要的作用。

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