内。
短时间培养转化酵
母细胞，以扩DNA 增
重组分子。
筛选和鉴定经转化处理
的酵母细胞，获得外源
检 基检因测高正效确表表达达的基目因的工产物 检
程菌 的酵母（检）
0.0
乙肝疫苗的制备
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菌种制备和发酵
用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发酵罐。
发酵过程应该具有下列特点： 原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机和无机氮源； 能容易进行 大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产；生物反应过程是以生 命体的自动调节方式进行的，多个反应像一个反应一样，在单一设备中 进行；生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；能够 高度选择性的进行复杂化合物在特定部分的反应，如氧化、还原、官能 团导入；生产过程中考虑防止杂菌的污染。
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疫苗的组成
疫苗的组成
抗原
免疫佐剂
乙肝疫苗的制备
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乙肝疫苗的制备
• 目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗--
重组酵母乙肝疫苗和重组CHO乙肝疫苗 ，其主要成分是乙肝病毒的表面抗原， 即一种乙肝病毒外衣壳蛋白，并非完整 病毒。这种表面抗原不含有病毒遗传物 质，不具备感染性和致病性，但保留了 免疫原性，即刺激机体产生保护性抗体 的能力。 乙肝表面抗原曾经是从乙肝病毒携带者 的血液，经纯化灭活等严格工序制备而 来，即血源性疫苗，该疫苗由于安全、 来源和成本等原因已被淘汰(如，有引 起血源性疾病的嫌疑和浪费大量的血）
滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分 子量宿主细胞内含物通过滤膜除去。
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凝胶层析
离子交换层析
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凝胶层析分离原理
• 单个凝胶珠本身象个"筛子"。不同类型凝胶的筛孔的大小
不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成 一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上 时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠 子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来 自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们 从柱子上洗脱下来所花费的时间越长！凝胶中只有很少的 孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠 之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大 小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。
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离子交换层析示意图
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乙肝疫苗的制备
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重组酵母构建
切
接
根毒用基用性分据表化因识内子已面学。别切切经 抗 合 相 酶 开测原成同将。定决法黏外的定直性源编簇接末D用外连成DN码基合端NAD源接乙因成的A和N基到重肝序目限A质因质连组病列的制粒的粒接分，转D分酶子N子将。A上含片细重，有段胞组构转分化子手导段入将酵母DN细A胞
发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生长和维持细 胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。 可添加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。
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分离纯化
离子交换层析 凝胶层析
无菌过滤 氢氧化铝共沉淀 无菌过滤
超滤
硫氰酸盐处理
微滤
疏水层析
细胞破碎微滤超滤 Nhomakorabea硅胶吸附
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乙肝疫苗的制备
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凝胶层析分离原理示意图
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凝胶层析
离子交换层析
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离子交换层析原理
• 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是
以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡 离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
• 乙肝疫苗的应用是预防和控制乙型肝炎的根本措施。
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乙肝疫苗的概念
• 乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗接种
后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体 存在于人的体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体 会立即作用，将其清除，阻止感染，并不会伤害 肝脏，从而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从 而达到预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预 防乙肝病毒感染的最有效方法。
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乙型病毒性肝炎
• 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝脏炎
性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝广泛 流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转 化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的 世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重 的一种疾病。乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季 均可发病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高的 趋势。
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细胞破碎 微滤 超滤
发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵 液分离，然后细胞通过高压匀浆机破碎，释放 出抗原。酵母的细胞壁较厚，比大肠杆菌难破 碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压力， 通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎。在细 胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。
细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗 细胞裂解物用0.2um中空纤维柱进行微滤。抗 原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤 膜，细胞碎片被膜拦截。
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乙肝疫苗的发展史
• 乙肝疫苗形成于1986年，为了得到乙肝疫苗，研
究人员从研究复试病毒，到酵母，并研究纯化的 蛋白质序列。并经过了大量的诱导免疫反应。
• 1991年，疫苗被应用于高危险人群。主要是一些
儿童，因为儿童的感染率极高。
• 2005年，美国推行常规的疫苗注射。给所有未注
射过乙肝疫苗的儿童注射。治疗性疫苗是指在已 感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通 过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病 恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的 产品或制品
• 离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电
荷的称之阳离子交换树脂；而带有负电荷的称之阴离子树脂。由于蛋 白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不 同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留 在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上 的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子 交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗 脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。