含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂：1M IPTG1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。
将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养过夜。
通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。
2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB培养液中，37℃通气培养过夜。
3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550＝0.1-1.0）。
4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0mM相同的温度继续通气培养。
5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。
细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。
生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。
生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。
低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。
IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。
所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。
6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。
二.大量表达靶蛋白1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。
2.取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液，在2L的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm，通气培养4小时，至对数生长中期。
3.以预实验确定的最佳IPTG浓度，最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。
4.收集菌液，4℃，5000g（5500rpm）离心15分钟收集沉淀，－70℃保存。
三.细菌破碎和蛋白质溶解所需特殊试剂：非变性裂解液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑，pH8.0超声破碎液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl , pH8.01.每200ml菌液离心所得沉淀以10ml非变性裂解液充分重悬，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mM。
2.超声破碎细菌，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。
工作时间5秒，间隙时间5秒，总时间20分钟（破碎时间一般不宜超过10分钟，菌量不超过1g）。
整个超声过程中探头离烧杯底部1厘米为佳，烧杯置于冰浴中。
3.超声破碎后，取1滴菌液于载玻片上，烤干后用结晶紫染色观察超声破碎是否完全，大肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。
破碎不完全可适当延长超声破碎时间。
4.将细菌破碎液以10000rpm，30分钟，4℃离心，收集上清。
用等同于上清体积的超声破碎液重悬沉淀。
5.分别取10微升上清和沉淀重悬液用于SDS-PAGE检测，以确定是包涵体表达还是上清表达。
其余置于－70℃保存。
四. Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略（一）若为上清表达所需特殊试剂：非变性裂解液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑，pH8.0Wash buffer: 50mM NaH2PO4 , 300 mM Nacl ,20 mM咪唑，pH8.0Elution buffer: 50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,250mM咪唑，pH8.01.离心后上清蛋白与Ni-NTA混匀，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时，使之充分混匀结合。
为了完全去除杂质，离心两次或离心后用0.4微米微孔滤膜过滤。
2.将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，速度可稍慢（5－6秒/滴），收集流出液体。
可以取样进行SDS-PAGE，看蛋白挂柱情况。
3.用Wash buffer 洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50－100倍，以便充分洗去杂蛋白。
为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间可以重复数次。
因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。
4.用Elution buffer 洗柱，用1.5mLEP管收集洗脱液，直至A280<0.1。
5.测定收集的洗涤液和洗脱液的A280，选择A280变化明显的管取样进行SDS-PAGE，分析组氨酸标签蛋白的分布。
根据A280和电泳图选择合并A280相近的管，弃掉没有目的蛋白的管。
目的蛋白的脱盐处理可以用透析，也可以超滤，还可以过分子筛。
如果需要更大的蛋白浓度，可以使用超滤的办法。
收集的蛋白-20℃保存。
说明：只经过Ni-NTA纯化，所得蛋白一般不纯，往往混有杂蛋白。
这时可以考虑进一步的纯化措施，比如DEAE,分子筛，疏水层析等。
（二）若为包涵体表达所需特殊试剂：细胞裂解液：50mM Tris-Hcl ,100 mM Nacl ,0.5%Triton X-100, pH 8.0变性裂解液：10mM NaH2PO4 ,10mM Tris-Hcl，8M尿素，pH8.0复性液：100mM NaH2PO4，10mM Tris-Hcl，2 mM还原型谷光甘肽，0.2 mM氧化型谷光甘肽Wash buffer: 100mM NaH2PO4，10mM Tris-Hcl，pH6.3Elution buffer: 100mM NaH2PO4，10mM Tris-Hcl，pH4.51. 将沉淀重悬液缓慢冻融离心，去上清，沉淀重悬于9倍体积的4℃细胞裂解液，每克菌体加入4mg脱氧胆酸，悬液室温放置5分钟，4℃，12000rpm×15分钟。
洗涤5次。
2. 每克沉淀重悬于9ml含0.1 mM PMSF，10 mM 2-巯基乙醇，2 mM还原型谷光甘肽和0.2 mM氧化型谷光甘肽的变性裂解液中，调节pH在10.7，室温放置60分钟。
3. 再用盐酸调pH至8.0，室温放置30分钟。
4. 4℃，12000rpm×15分钟离心，留上清待用。
沉淀重悬于100微升1×SDS蛋白上样缓冲液中。
取10微升上清加10微升2×SDS上样缓冲液，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，分析溶解程度。
5. 稀释透析复性：每毫升上清缓慢加入9毫升6M尿素的复性液中。
装入经10 mM NaOH和1.0 mM EDTA煮沸30分钟，蒸馏水洗涤干净的透析袋中。
在4℃ 10倍以上体积含有2M尿素的复性液中透析5个小时。
6. 取出透析袋，再放入4℃ 10倍以上体积的复性液中透析过夜。
7. 取出透析袋中的蛋白，测定其A280，加入相应体积的Ni-NTA树脂混匀，按与上清纯化相同的方法上柱纯化，但是Wash buffer和Elution buffer 用包涵体纯化的pH递减的缓冲液。
五．Ni-NTA 树脂的再生（Qiagen公司）当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色，此时Ni-NTA树脂需要再生后才能使用。
所需试剂：再生缓冲液：6M盐酸胍＋0.2M乙酸2％SDS（m/V）25％，30％，50％，75％的乙醇（V/V）100mM EDTA,pH8.0100mM NiSO4裂解缓冲液A：10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +6M盐酸胍, pH8.0裂解缓冲液B：10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +8M尿素，pH8.0 步骤如下：1.用下列试剂依次彻底冲洗层析柱：2倍柱体积的再生缓冲液5倍柱体积的双蒸水3倍柱体积的2％SDS1倍柱体积的25％的乙醇1倍柱体积的50％的乙醇1倍柱体积的75％的乙醇5倍柱体积的100％的乙醇1倍柱体积的75％的乙醇1倍柱体积的50％的乙醇1倍柱体积的25％的乙醇1倍柱体积的双蒸水5倍柱体积的100mM EDTA1倍柱体积的双蒸水2倍柱体积的100mM NiSO42倍柱体积的双蒸水2倍柱体积的再生缓冲液2.2倍柱体积的适当的裂解缓冲液（A或B）平衡Ni-NTA树脂3.将再生后的Ni-NTA树脂按1：1的比例保存在30％的乙醇中GST-融合蛋白的纯化策略所需特殊试剂：PBS :140mM Nacl ,2.7mM Kcl ,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4Elution buffer : 10 mM Glutathione ,50mM Tris-Hcl，pH8.01.离心后上清加入预先用PBS平衡的400微升Glutathione-Sepharose-4B，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时，使之充分混匀结合。
2.将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，速度可稍慢（5－6秒/滴），收集流出液体。
可以取样进行SDS-PAGE，看蛋白挂柱情况。
3. 用PBS洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50－100倍，以便充分洗去杂蛋白。
为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间可以重复数次。
因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。
4. 用Elution buffer 洗柱，用1.5mLEP管收集洗脱液，直至A280<0.1。
若蛋白需求量大，为了洗脱的更干净，可以加大洗脱的体积（如100毫升），这时可以用烧杯收集。
5. 测定收集的洗涤液和洗脱液的A280，选择A280变化明显的管取样进行SDS-PAGE，分析目的蛋白的分布。
根据A280和电泳图选择合并A280相近的管，弃掉没有目的蛋白的管。
目的蛋白的脱盐处理可以用透析，也可以超滤，还可以过分子筛。
如果需要更大的蛋白浓度，可以使用超滤的办法。
收集的蛋白-20℃保存。
说明：只经过GST纯化，所得蛋白一般不纯，往往混有杂蛋白。
这时可以考虑进一步的纯化措施，比如DEAE,分子筛，疏水层析等。
1. 平衡。
在纯化之前，确保离子交换胶床已被平衡。
通常用pH8.0的20mM Tris-Hcl冲洗柱子3-5个柱体积，冲洗速度可以适当快些，比如30-50毫升/小时，直至达到平衡。
缓冲液pH要求高于目的蛋白等电点2个左右pH单位。
如果某一目的蛋白的等电点为6.5，这时选择pH8.5的20mM Tris-Hcl缓冲液更为合适。
2. 上样。
要求蛋白样品的离子浓度最好低于15 mM，缓冲液pH高于目的蛋白等电点2个左右pH单位，缓慢上样，便于目的蛋白更好的和胶结合。
打开蛋白检测系统，在层析图谱上观察上样情况。
上样完毕后，用pH8.0的20mM Tris-Hcl冲洗柱子2-3个柱体积，在层析图谱上表现为回到基线位置。
上样后的穿过液取样电泳，分析目的蛋白的挂柱情况。