生物化学实验指导吕杰编著新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室内容介绍《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。
该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。
目录实验一氨基酸纸层析 (4)实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸 (5)实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度 (7)实验四酪蛋白的制备 (8)实验五葡萄糖标准曲线的绘制 (10)实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定 (12)实验七酵母RNA的分离及组分鉴定 (14)实验八维生素C的定量测定 (16)实验一氨基酸纸层析一、实验目的1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。
二、实验原理纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。
由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。
缺点是展开时间较长。
分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。
在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。
溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。
三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：标准氨基酸溶液2、仪器: 层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。
3、试剂：（1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。
（2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；（3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮1—5克，丙酮100毫升四、实验步骤：纸层析(1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm 画一个“+”作为点样位置，共5个点。
(2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。
每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。
(3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约1.5cm，约50－60ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。
(4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。
五.结果分析：(1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；(2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。
Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离=原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离六、思考题：1、何谓分配层析法和分配系数？实验二DNS-Cl法测定N末端氨基端一、实验目的1、学习聚酰胺薄膜层析的方法。
2、学习DNS-Cl测定氨基酸的原理及方法。
二、实验原理纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。
由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。
缺点是展开时间较长。
分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。
三、实验材料、仪器和试剂：1、实验器材层析缸毛细管紫外灯烘箱恒温箱聚酰胺薄膜吹风机2、试剂：①各种层析纯标准氨基酸②DNS-Cl丙酮溶液（称取25mg DNS-Cl溶于10mL丙酮中，贮于棕色瓶中，至于冰箱保存，一个月内稳定）③0.2mol/L NaHCO3 溶液④NaOH 1M⑤HCl 1M⑥展开剂I 88%甲酸：水=1.5:100（v/v）⑦展开剂II 苯：冰醋酸=9:1（v/v）四、实验步骤：1、氨基酸的DNS化分别取0.2-0.3mg的层析纯标准氨基酸及样品氨基酸溶于0.5mL 0.2mol/L的NaHCO3 溶液中，各取0.1mL于有玻璃塞的试管中，加入0.1mL DNS-CL的丙酮溶液，测pH值，必要时用NaOH 调pH至9.0-9.5，于室温放置2-4h，冷风吹除丙酮后，加HCl调pH2-3水解16-18h，加入乙酸乙酯抽提，分层后取有机相；2、聚酰胺薄膜的准备将聚酰胺薄膜剪成7*7cm的方块，在距边0.5cm处画互为垂直的两条基线，交叉点为原点，若只做单向层析，则只画一条基线，在基线上每隔1cm画一个点样点。
3、点样用毛细管取样，点在点样点上，点样点直径应小于2mm，若多次点样，点一次吹干一次。
4、展层将点好样的聚酰胺膜卷成圆筒形，点样侧在筒内，放入层析缸内，槽内加入5-10ml的展开液I进行展开，溶剂到达距顶部0.5cm时，取出膜吹干。
进行双向层析，第一向层析完毕，取出完全吹干，将膜转90°，用展层液II 展开。
为了区分DNS-谷氨酸和DNS-天冬氨酸，DNS-苏氨酸和DNS-丝氨酸，DNS-丙氨酸和DNS-NH2，可在展开后，吹干，接着用其它展层液在同一方向上展开。
5、DNS-氨基酸的检测展层结束后，取出薄膜用吹风机吹干，在360nm或者280nm紫外灯下检测，DNS-氨基酸应呈黄色荧光，用样品的层析谱与标准的DNS-氨基酸层析谱比较可鉴定样品氨基酸的种类。
五、结果分析：(1) 用铅笔将层析荧光点描出来；(2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。
Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离=原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离六、思考题：1、为什么用棉线而不是橡皮筋固定薄膜？实验三考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质一、实验目的1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法二、实验原理此方法是1976年Bradform建立。
考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。
大大提高了测定蛋白质的灵敏度（1ug）三、器材与试剂器材1. 可见光分光光度计2. 刻度移液管3.移液枪试剂1. 0.15M生理盐水2. 考马斯亮蓝试剂(考马斯亮蓝G250 100mg 溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml。
最终试剂中含有0.01% G250，4.7% 乙醇，8.5% 磷酸)3. 0.1mg /ml蛋白质标准液（结晶牛血清蛋白，预先经凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15M生理盐水配制成0.1mg/ml蛋白溶液。
）4. 两种未知浓度的蛋白质溶液。
四、实验步骤1. 标准曲线的制作(2) 加入3.0ml考马斯亮蓝G250试剂, 充分振荡混合，放置5min后，测定A595值。
(3) 分光光度法的基本原理和分光光度计的使用方法(4) A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
2. 未知溶液蛋白质含量的测定(1)未知蛋白质溶液:取实验室预备的未知蛋白质溶液，各吸取样品提取液0.1ml，加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡混合，放置5min后，测A595 值(2) 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋白含量。
(3) 如果所测定的A595值不在标准曲线内，该如何处理？3. 结果计算根据标准曲线求出样品中蛋白质的含量。
五、复习思考题、作业题：1. Bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响？2．为什么标准蛋白质必须用凯氏定氮法测定纯度？3. 根据蛋白质的呈色反应，测定蛋白质的方法还有哪种？根据所学知识推断各种测定方法有何优点、缺点实验四酪蛋白的制备一、实验目的1、学习从奶粉中制备酪蛋白的原理和方法。
2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。
二、实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。
酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。
三、材料、试剂与器具（一）材料新鲜牛奶（一）试剂1、95%乙醇1200mL2、无水乙醚 1 200mL3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液300ml先配A液与B液A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。
B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。
取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。
4、乙醇——乙醚混合液乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）（二）器具1、离心机2、抽滤装置3、精密pH试纸或酸度计4、电炉5、烧杯6、温度计四、操作步骤（一）酪蛋白的粗提100mL牛奶加热至40℃。
在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。
将上述悬浮液冷却至室温。
离心15分钟（3000 r /min）。
弃去清液，得酪蛋白粗制品。
（二）酪蛋白的纯化1、用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。
2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。
最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
3、将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。
（三）准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%）100% 测得含量得率:理论含量式中理论含量为3.5g/100mL 牛乳。
五、注意事项1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。
最好用酸度计测定。
2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。
3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。
六、实验报告1、根据实际操作，以流程图形式总结酪蛋的制备方法。
2、合理分析实验所得率七、思考题1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？2、试设计另一种提取酪蛋白的方法？实验五葡萄糖标准曲线的绘制一、实验目的掌握葡萄糖标准曲线的绘制方法，进一步掌握分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。