3
2
0
1
3
10人
水浴锅1台
试管2支、滤纸3张
2
影响酶活性的因素
3
2
0
1
3
10人
水浴锅1台
试管5支
3
血清醋酸纤维素薄膜电泳
6
2
0
2
1
25人
电泳仪1台电泳槽1台
薄膜条1张干
4
血清胆固醇的测定
3
2
0
1
1
25人
分光光度计1台
试管3支
5
转氨基作用
6
2
0
1
1
25人
烘干箱1台层析缸1个
层析滤纸1张
6
血清尿素氮的测定
2、通电一般电压用110～140V，电流约0.4～0.6mA／cm，时间45～60min。
3、染色关闭电源后立即将膜取出，放入染色液中浸染2～3min，然后移入漂洗液中漂洗数次，至蛋白条带清晰，背景无色为止。
4、定量取试管6支，编号依次为0（空白）、A、α1、α2、β、γ，将电泳图谱亦按A、α1、α2、β、γ蛋白区带剪开，分别装入相应号码试管中。再在图谱两端无蛋白部位剪一条宽约α1带的空白带放入空白管中。各管中加0.4mol/L NaOH 4ml，振摇数次，使染料色泽浸出，30min后，在620nm波长下进行比色，以空白管校正零点，读取清蛋白及α1、α2、β及γ球蛋白各管的吸光度。
2
1、稀释唾液的配制
将痰吐尽，用水漱口，再含蒸馏水做咀嚼运动，2分钟后吐入烧杯中，再用滤纸过滤后待用。
2、酶的特异性实验
取2支试管标号后按下表加入试剂。
试剂
管号
缓冲液
（pH6.8）
淀粉溶液
（1%）
蔗糖溶液
（1%）
稀释唾液
1
20滴
10滴
-
5滴
2
20滴
-
10滴
5滴
各管混匀后，放入37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入班氏试剂20滴，放入沸水中煮沸，观察结果。
唾液淀粉酶可催化淀粉逐步水解，生成大小不同的糊精及最后水解成麦芽糖。淀粉及糊精遇碘各呈不同的颜色反应。直链淀粉遇碘呈蓝色，糊精按分子的大小遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色。最小的糊精和麦芽糖遇碘不显色。根据颜色反应，可以了解淀粉水解的程度。由于在不同的温度、不同的酸碱度下唾液淀粉酶活性高低不同，所以淀粉水解的程度也不同。因此，通过与碘产生的颜色反应判断淀粉水解的程度，来了解温度、pH、和激活剂与抑制剂对酶促反应的影响。
5、激活剂和抑制剂的影响
管号
试剂
1%淀粉溶液（滴）
1%NaCl
（滴）
1%硫酸铜（滴）
1%硫酸钠
（滴）
蒸馏水
（滴）
稀释唾液（滴）
1
20
2
-
-
-
10
2
20
-
2
-
-
10
3
20
-
-
2
-
10
4
20
-
-
-
2
10
取4支试管，编号，按照下表加入试剂。
将上面4支试管放入37℃恒温水浴中保温10分钟。取出分别滴加碘液2～3滴，摇匀，观察现象，说明原因。
④ 将操作“2”的滤液漏斗置于1支小试管上，用玻棒戳穿滤纸尖部，加少量蒸馏水将滤纸上的沉淀粉洗入试管内，摇匀后观察和解释结果。
（二）重金属盐和三氯乙酸沉淀蛋白质
1. 原理
重金属粒子如Pb2+、Cu2＋、Hg2+、Ag+等可与蛋白质分子上的羧基结合生成不溶性蛋白质金属盐而沉淀。三氯乙酸属于生物碱试剂，能与蛋白质分子上的氨基结合而沉淀。它们均可引起蛋白质分子的变性和失去生物学活性。
4、pH对酶促反应的影响
(1)取3支试管,编号后按下表加入各种试剂。
剂
试
管号
pH5.0
缓冲液
pH6.8
缓冲液
pH8.0
缓冲液
淀粉溶液
1%
稀释唾液
1
20滴
-
-
10滴
5滴
2
-
20滴
-
10滴
5滴
3
-
-
20滴
10滴
5滴
（2）将上面三支试管放入37℃恒温水浴中保温10分钟。
（3）取出试管，分别加入1滴碘液，观察三支试管颜色的区别，说明pH对酶促反应的影响。
实验二 影响酶活性的因素
【预习要求】
预习各小实验的具体实验原理和操作内容
【实验目的】
验证酶的特异性，观察影响酶促反应的一些因素，加深对酶性质的认识。
【实验内容】
淀粉酶能催化淀粉水解，生成的麦芽糖属于还原性糖，能使班氏试剂中二价铜离子还原成一价亚铜，生成砖红色的氧化亚铜。淀粉酶不能催化蔗糖水解，所以不能产生具有还原性的葡萄糖和果糖，蔗糖本身又无还原性，故不与班氏试剂产生颜色反应。
二、实验操作
1、点样将醋酸纤维薄膜(2.5cm×8cm)一条，浸于巴比妥缓冲液，待完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的溶液，再于薄膜的无光泽面的一端2.0cm处，用小玻片蘸取少许血清，垂直印于膜上，待血清渗入薄膜后，以无光泽面向下，两端用数层浸湿的滤纸(或纱布)贴紧，加盖，平衡2～3min，然后通电。
2、操作：
1）取试管4支，编号，按下表操作
管号
试剂 （滴） 1 2 3 4
5%蛋白质溶液 20 20 20 20
1% 醋酸 ＿ 1 ＿ ＿
10% 醋酸 ＿ ＿ 10 ＿
10% NaOH ＿ ＿ ＿ 10
2）将上述试管同时放入沸水浴中加热，观察并记录各试管出现的现象，解释变化原因。
3）取出试管，冷却后于第3管中慢慢滴入10%氢氧化钠溶液并观察现象。
三、考试方法及成绩评定方法
占总成绩之比
总分
分数分配
考核目的要求
30%
30
移液管正确使用方法
10
考察学生平时对移液管的使用是否正确与熟练程度
移液枪的正确使用方法
10
考察学生平时对移液枪的使用情况是否正确与熟练程度
紫外分光光度计的正确使用方法
10
考察学生平时对紫外分光光度计的使用情况是否正确与熟练程度
四、说明
二、基本要求
1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。
2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。
3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。
4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。
4）向第4管中慢慢滴入10%的醋酸溶液并观察现象。
【教学方法】
1.课堂讲授
2.指导学生操作
3.课堂提问
4.课外实验报告作业
【复习思考题】
1. 什么因素可导致蛋白质的沉淀作用？举例说明。
2. 蛋白质的沉淀有几种？试举例说明。
3. 蛋白质的沉淀与变性之间有何关系？蛋白质在发生沉淀和变性后，其性质发生哪些变化？
3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计
4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。
六、各实验项目教学大纲
实验一 蛋白质的沉淀反应
【预习要求】
预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。
【验目的】
1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；
2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
5、计算吸光度总和T为各种蛋白吸光度的总和：T = A +α1 +α2 +β+γ。分别按下面算式计算各组分蛋白质的百分数：清蛋白(%)＝(A/T)×100%α1球蛋白(%)＝(α1 /T)×100%α2球蛋白(%)＝(α2 /T)×100%β球蛋白(%)＝(β/T)×100%γ球蛋白(%)＝(γ/T)×100%现在许多实验室采用光密度计定量法。待薄膜完全干燥后，浸于透明液中约5～10min，取出平贴在玻璃板上，完全干燥后成为透明的膜。然后在光密度计上测定吸光密度，并可绘制成曲线，或者直接计算出各种蛋白质的百分含量。
3、温度对酶促反应的影响
（1）取三支试管，编号，每管加入pH6.8缓冲液20滴。1%淀粉溶液10滴。
（2）将第一支试管放入37℃恒温水浴，第二支试管放入沸水浴，第三支试管放入冰浴。
（3）放置5分钟后，分别向各试管中加入稀释唾液5滴，再放回原处。
（4）10分钟后，分别向各试管中加入碘液1滴，观察三支试管中颜色的区别，说明温度对酶促反应的影响。
《生物化学》实验教学大纲
课程类别：专业基础
适用专业：本科临床学专业
课程总学时：实验学时：32
实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程
开课实验室名称：生化实验室
一、目的和任务
生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。
实验教材及参考书：
1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010
参考资料：
1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011
五、实验项目数据表