RT-PCRLeabharlann 验原理RT(反转录)PCR
m-RNA
c-DNA
PCR产物
这R里T-修PC改R标实题验原理
RT-PCR实验步骤——提取总RNA
TRIzol法抽提总RNA 1、细胞1×107 或组织100mg,加1mlTRIzol (细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底， 后转至EP管）
颠倒混匀10下，室温5分钟。 2、氯仿1/5体积（0.2ml），颠倒混匀10下，室温5分钟。 3、4℃，离心12000g，15分钟。 4、转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中，加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟。 5、4℃，离心12000g，10分钟。 6、弃上清，加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml。 7、4℃离心7500g，5分钟。 8、弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥），溶于DEPC水中至20μl（可在55-60℃水中，<10分 钟助溶）。 9、紫外分光光度计测总RNA浓度。
混匀，离心，42℃ 50min。
3、95℃ 10min（破坏MLV,终止反应），4℃保存。
RT-PCR实验步骤——聚合酶链反应(PCR)
PCR反应：
反应体系：总体积20μl(50μl)
试剂
浓度
Taq Buffer 10×
dNTP
10mM
上游引物
10pmol/μl
下游引物
10pmol/μl
cDNA模板
琼脂糖凝胶电泳结果分析
DNA分子中含有磷酸基和碱基，在生理条 件下，磷酸基中的羟基发生解离，因此 DNA带负电在电场中向正极移动。
数量分析：条带的宽度、荧光的亮度 质量分析：纯度，分子量
琼脂糖凝胶电泳结果分析
选择=结果
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RT-PCR实验步骤——反转录（RT）
逆转录反应：
1、 RNA 1-5μg,加入适量的DEPC水至11μl Oligo(dT)15 1μl 混匀，离心，70℃ 10min。
2、立即冰水浴。
10X
PCR buffer 2μl
25mM MgCl2
2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT
2μL
RT-PCR技术背景
基因组DNA (genomic DNA) 信使RNA (messenger RNA, mRNA) 蛋白质产物
变性 退火 延伸
RT-PCR技术目的
通过反转录(reverse transcription， RT)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法，检测 目的基因在特定组织或细胞中、mRNA 水平的表达丰度
Taq酶
2.5U/μl
DEPC水
混匀
体积 (5μl_) (0.5μl) (1μl) (1μl) (1-10μl) (1μl) 20μl-4.3μl
28-36循环，4℃保温
RT-PCR实验步骤——琼脂糖凝胶电泳
加1-10μl PCR产物与上样缓冲液（12.5μl）混匀，加样，电泳。 成像系统进行成像分析。