分子水平
DNA sequence
?
Proteins Structure Function
All Cell
基因表达的调控层次
DNA
Primary transcript
mRNA
Transcriptional Post-transcriptional
control
control
nucleus
Inactive mRNA
功能蛋白质组学
To study protein-protein interaction, 3-D structures, cellular localization and PTMs in order to understand the physiological function of the whole set of proteome.
第二节 生物大分子相互作用分析技术
1. 研究思路 2. 分类 3. 技术介绍
生物大分子相互作用分析研究思路
鉴定与目标分子相 互作用的所有可能 大分子
详细描述其生物功能 及相互作用对其功能 的影响
鉴定出相互作用且在生理 状态下得到了验证和合理 的解释
生物大分子相互作用分析技术
❖ GST 融合蛋白技术(GST pull-down) ❖ 免疫共沉淀(Immunoprecipitation, Co-IP ) ❖ 串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification，TAP) ❖ 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid) ❖ 噬菌体展示(Phage display) ❖ 细胞内蛋白质共定位(Co-localization) ❖ 荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，
FRET)
❖ 表面等离子共振(surface plasmon reson pull-down
assay）
——基于重组蛋白表达纯化技术的体外分析系统
基本原理：是将靶蛋白-GST融合蛋
白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为 与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱 饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获 与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白), 洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析, 从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选 相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋 白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、 表达系统以及体外转录翻译系统等方法 获得。
引言
原核生物细胞结构
质膜 肽聚糖
被膜
引言
真核生物细胞结构
植物细胞
动物细胞
细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核
引言
The approximate composition of a bacterial cell.
细胞中的大分子
Macromolecules in Cells
第一节 生物大分子相互作用分析的意义
举例
GST pull down验证两种已知蛋白质 （X-Y）的相互作用
Y-GST GST
input
X-GST GST
input
Y-GFP + + +
X-GFP + + +
105kD
Y-GFP
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
GST pull-down assay
Purification of protein
GST fusion protein Glutathione column
Glutathione bead
Tags Pull-Down 方法的组成
SDS-PAGE gel
Controls
R
Add prey
R
Wash
R
Elution
Analysis
Analysis
实验流程
GST融合蛋白 + 谷胱甘肽-琼脂糖微珠 X GST
Y 细胞裂解物
4℃下孵育2h tube
X GST Y
GST pull-down 应用
鉴定未知相互作用的蛋白 鉴定预测的或已知的相互作用
Quantitative study of protein expression between samples that differ by some variable
结构基因组学
Goal is to map out the 3-D structure of proteins and protein complexes
第六章 生物大分子相互作用
分析技术
基础医学院
刘芸
主要内容
第一节 生物大分子相互作用分析的意义 第二节 常见的生物大分子相互作用分析方法 第三节 生物大分子相互作用分析新进展（FRET、
SPR）
引言
细胞结构 cell
真核生物细胞 eukaryotic cell
原核生物细胞 prokaryotic cell
mRNA
mRNA degradation control
translation
control
protein
active protein
Post-translation control
cytoplasm
生命机制
Protein complex
Signaling net work
蛋白质组学的分类
表达蛋白质组学
蛋白质信息的不同层次
蛋白质结构和序列特点 蛋白质进化过程和保守序列 蛋白质表达谱 蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器或
结构 蛋白质翻译后修饰情况 了解与其相关联的其他细胞蛋白质
生物大分子复合物的类型
❖ 蛋白质同源二聚体(homodimer) ❖ 蛋白质异源二聚体(heterodimer) ❖ 蛋白质多聚体(polymer) ❖ 蛋白质-DNA复合物(protein-DNA complex) ❖ 蛋白质-脂质复合物(protein-lipid complex) ❖ 蛋白质-RNA复合物(protein-RNA complex) ❖ DNA-DNA复合物(DNA-DNA complex) ❖ ……
Resin——树脂 Bait——诱饵蛋白 Prey——捕获蛋白 Tags ——标签（GST, His, Flag, HA, MBP）
R
tag
bait prey
实验设计思路
Pull-down experiment
R R R R
Wash Add prey Wash Elution
Bait Prey
S
C